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《人結(jié)核桿菌熱休克蛋白65重組BCG疫苗的構(gòu)建、表達及鑒定》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文摘要目的：構(gòu)建大腸桿菌一分支桿菌分泌型原核穿梭表達質(zhì)粒(pBcG—SP)。將結(jié)核分支桿菌熱休克蛋白65KD(HSP65)的全長基因克隆入這個新型的載體，并將其導(dǎo)入恥垢分支桿菌和BCG中表達．構(gòu)建人結(jié)核桿菌HSP65重組BCG疫苗，為我室下一步的研究工作奠定基礎(chǔ)。方法：用PCR技術(shù)從BcG基因組中擴增出抗原85B(A985B)的信號肽DNA序列，從pCMVMTHSP65質(zhì)粒中擴增出HSP65全長基因。信號肽DNA序列用BamnI和Nsil分別消化，HSP65DNA序列用Nsil和Kpnl分別消化。同時
2、制備大量的表達載體pBOG-2100，用BamHI和KpnI消化。利用基因重組技術(shù)構(gòu)建一個分泌型的原核穿梭表達質(zhì)粒(pBCG-SP-HSP65)。利用電穿孔的方法將該質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入恥垢分支桿菌和BcG中，經(jīng)熱誘導(dǎo)后，用SDS—PAGE電泳來觀察其表達水平。利用western-blot來檢驗HSP65的生物學(xué)活性。／結(jié)果：PCR擴增出120bp的信號肽DNA片段和1600bp的熱休克L{}_自喝5DNA片段，并插入到原核穿援表達載體pBCG一2100中構(gòu)建分泌型原核穿梭表達質(zhì)粒pBCG-SP-HSP65。酶切鑒定、pcR和測序分析結(jié)果表
3、明，所克隆的信號肽DNA片段和熱休克蛋白65DNA片段與報道結(jié)果完全一致，重組體的連接方向正確，閱讀框與預(yù)期完全一致。分泌型原核穿梭表達質(zhì)粒pBCG-SP-HSP65構(gòu)建成功。SDS—PAGE電泳結(jié)果表明，結(jié)核分支桿菌熱休克蛋白65KD能在BCG體內(nèi)表達，并且其表達量有顯著的提高。通過Western-blot證實所產(chǎn)生的蜃白能與結(jié)核分支桿菌熱休克蛋白65KD的抗體發(fā)生特異性的結(jié)合?！劢Y(jié)論：成功構(gòu)建了分泌型原核穿梭表達載體pBCG—sP，結(jié)核分支桿菌熱休克蛋白65KD基因通過此載體在BCG中能高效表達，并且表達的HSP65具有生物學(xué)活
4、性。人結(jié)核桿菌HSP65重組BCG疫苗構(gòu)建成功。關(guān)鍵詞：休克蛋白嘟；Ic爭、重組BCG華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文Abstractobjective：ToconstructasecretingshuttleprokaryoticexpressingplasmidthatcansurvivalinE．coliandMycobacterium．ToinsertthewholeDNAsequenceofheatshockprotein65thatcomesfromhumanMycobacteriumtuberculosiSintot
5、hevectorandtotranfertheplasmidintoMycobacterialsmegmatiSandBCGtoconstructrecombinantBCGvaccinethatholdstheHSP65DNAsequenceofhumanMycobacteriumtuberculOSiSbyelectroporationandtomakeabaseforournextresearchwork．Methods：Signalpeptidethatcomesfromantigen85BWaSamplifledfromB
6、CGgenomebyPCRandthewholeheatshockprotein65DNAsequenceofhumanMycobacteriumtuberculosiSwasamplifiedfromthep刪SP65plasmidbyPCR．TheDNAsequencesofsignalpeptideweredigestedbyBamHIandNsiI．TheDNAsequencesofheatshockprotein65weredigestedbyKpnlandNsiI．Atthesametime．theplasmidsofs
7、huttleprokaryoticexpressingplasmidpBCG一2100werepropagatedbythethousandsandweredigestedbyKpnlandBamnl．ByDNArecombinationtechnology，asecretingshuttleprokaryoticexpressingplasmid(pBCG—SP．．HSP65)wasconstructed．TheplasmidwastransferredintoBCGandMvcobacterialsmegmatiSbyelect
8、roporation．Afteritwasinducedbyheat，weobservedtheexpressingefficiencyofheatshockprotein65ofhumanMycobacteriumtuberculo
