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《低氧誘導(dǎo)因子-1對(duì)肝細(xì)胞生長因子基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位淪文中文摘要低氧誘導(dǎo)因子一1對(duì)肝細(xì)胞生長因子基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究目的：第一部分：(1)觀察氯化鈷(CoCl2)及HIF．1a過表達(dá)對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞及人宮頸癌Hela細(xì)胞存活及凋亡狀況的影響。(2)觀察CoCl2模擬的低氧以及由peDNA3一HIF—let真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染介導(dǎo)的HIF．1ct過表達(dá)對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞和Hela細(xì)胞中HGF／c-Met系統(tǒng)mRNA和蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)。(3)對(duì)人HGF基因啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，尋找可能介導(dǎo)HGF低氧表達(dá)調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子作用位點(diǎn)。第二部分：根據(jù)
2、生物信息學(xué)分析結(jié)果，在Hela和轉(zhuǎn)染效率較高HEK293細(xì)胞中，研究HIF．1a對(duì)TGF．B2基因表達(dá)調(diào)控的作用機(jī)制，并進(jìn)一步觀察重組轉(zhuǎn)化生長因子．B2(transforminggrowthfactor-132，TGF一132)對(duì)Hela細(xì)胞中HGF表達(dá)的影響，方法：第一部分：(1)體外培養(yǎng)乳鼠原代心肌細(xì)胞和Hela細(xì)胞，應(yīng)用MTT和流式細(xì)胞儀檢測(cè)CoCl2對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞和Hela細(xì)胞存活、增殖及凋亡的影響。(2)構(gòu)建pcDNA3一HIF．1et真核表達(dá)質(zhì)粒(3)免疫印跡檢測(cè)CoCl2和pcDNA3一HIF—la質(zhì)粒轉(zhuǎn)
3、染誘導(dǎo)的HIF．1et過表達(dá)后，Hela細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Bcl．2和Bax的表達(dá)。(4)RT-PCR檢測(cè)1001maol／LCOCl2作用6～72h后，心肌細(xì)胞中HGFmRNA的表達(dá)。(5)WesternBlot檢測(cè)1001xmol／LCoCl2作用心肌細(xì)胞12h后HIF．1a蛋白的表達(dá)。(6)相對(duì)熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)COCl2和pcDNA3．HIF．1et質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，Itela細(xì)胞中HGF／c—MetmRNA的表達(dá)。(7)ELISA檢測(cè)COCl2對(duì)Hela細(xì)胞中分泌性HGF蛋白表達(dá)的影響。(8)利用生物信息學(xué)分析
4、人HGF基因啟動(dòng)子區(qū)可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。第二部分：(1)構(gòu)建pGL3。EPO．HRE熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒和pGL3．TGF．B2及其五個(gè)突變體的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒。(2)WesternBlot和雙熒光素酶報(bào)告基因法檢測(cè)CoCl2和peDNA3．HIF．1et質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，Hela和HEK293細(xì)胞中HIF．1et蛋白的表達(dá)量及其DNA結(jié)合活性。(3)相對(duì)熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)250p．mol／LCoCl2單獨(dú)作用Hela和HEK293細(xì)胞6h后，TOF—B2mRNA的表達(dá)，以及CoCl2處理和peDNA3．HIF．1et質(zhì)
5、!墾墾蘭登蘭墮!璺堡塑墾登奎蘭堡主蘭垡笙苧粒轉(zhuǎn)染后，Hela細(xì)胞中TGF．B2mRNA的表達(dá)。(4)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)COCl2和pcDNA3．HIF—la質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)TGF．02啟動(dòng)子區(qū)報(bào)告基因及其相應(yīng)突變載體報(bào)告基因活性的影響。(5)在HEK293細(xì)胞中進(jìn)行CHIP實(shí)驗(yàn)，證實(shí)HIF-la在TGF—p2基因啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)。(6)ELISA法檢測(cè)重組TGF—B2作用Hela細(xì)胞后，HGF蛋白的表達(dá)量。結(jié)果：第一部分：(1)測(cè)序結(jié)果表明，pcDNA3．H1F．1a表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功，可以用于下一步的實(shí)驗(yàn)。(2)50～
6、250Hmol／LCoCh作用12h后，心肌細(xì)胞的存活率明顯降低；與之相反，O～150pmol／LCoCl2不會(huì)改變Hela細(xì)胞的增殖活性，加大濃度后會(huì)明顯減少活細(xì)胞數(shù)量；250～5001amol／L范圍內(nèi)的CoCl2可以引起Hela細(xì)胞的少量凋亡；Hela細(xì)胞中，HIF一1c‘過表達(dá)引起的凋亡和凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2與Bax比值降低有關(guān)。(3)乳鼠心肌細(xì)胞中，CoCh可以誘導(dǎo)HIF．1a表達(dá)，并降低HGFmRNA的表達(dá)水平。(4)Hela細(xì)胞中CoCl2和pcDNA3-HIF．】n質(zhì)粒轉(zhuǎn)染可以顯著降低HGFmRNA的
7、表達(dá)，卻增加其受體c—MetmRNA的表達(dá)。(5)ELISA結(jié)果顯示，CoCl2作用Hela細(xì)胞6h后，HGF分泌蛋白的水平明顯呈濃度依賴性增高，而在其它時(shí)間點(diǎn)，HGF并沒有明顯升高。(6)生物信息學(xué)分析顯示HGF啟動(dòng)子區(qū)可能受到TGF．132的調(diào)節(jié)。第二部分：(1)野生型TGF．p2啟動(dòng)子區(qū)報(bào)告基因及其相應(yīng)5個(gè)HRE突變報(bào)告載體以及pGL3．EPO，HRE報(bào)告基因構(gòu)建成功。(2)CoCh處理和pcDNA3．H1F—lG質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela和HEK293細(xì)胞后，HIF．1“蛋白表達(dá)均增加。但是，HIF．1a過表達(dá)后，其DN
8、A結(jié)合能力在HEK293細(xì)胞中大約增高250倍，而在Hela細(xì)胞中只增加4．5倍左右。(3)250肚mol／LC002作用6h后，HEK293細(xì)胞中TGF一132mRNA水平輕度增高約1．4倍，但Hela細(xì)胞中卻降低大約3倍。進(jìn)一步用CoCl2和pcDNA3．HIF．1a質(zhì)粒轉(zhuǎn)染處理Hela細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)TGF—B2mRNA水平顯著下
