綿羊肺炎支原體生物學特性及其PCR快速檢測技術的研究

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1、河北農業(yè)大學碩士學位論文綿羊肺炎支原體生物學特性及其PCR快速檢測技術的研究姓名：張莉申請學位級別：碩士專業(yè)：預防獸醫(yī)學指導教師：孫繼國2003.6.1塑j!查些查堂堡主蘭些堡苧———摘要挑選綿羊肺炎支原體(Mycoplasmaovipneumoniane，下稱MO)適宜的培養(yǎng)基，測出適宜于MO的培養(yǎng)溫度、濕度、pH值以及最佳血清含量。同時研究其菌落菌體形態(tài)特征、生化特性、超微結構，并對河北省的邢臺、保定、邯鄲、廊坊四個地區(qū)部分羊場進行MO的流行病學調查。以病理組織學技術對MO的致病機理進行研究。用SD

2、S--PAGE法將分離株與三種支原體標準株進行菌體主要蛋白抗原多肽分析。結果表明，MO在37℃，pH7．8的KM2和Hayflick培養(yǎng)基中都能良好生長．除基礎營養(yǎng)物質外，培養(yǎng)基添加15％以上血清時MO生長旺盛，低于10％MO不生長。蘭種血清培養(yǎng)效果馬血清>兔血清，滅活的豬血清培養(yǎng)效果最差。MO菌落為無中心臍的“桑椹”狀，明顯區(qū)別與典型的“煎蛋狀”菌落。電鏡下菌體無細胞壁，細胞膜由三層膜組成，胞內含有顆粒狀核糖體，在細胞膜外有一層絨毛狀的莢膜。用微量間接血凝試驗對河北省四個地區(qū)的MO感染情況進行流行病學

3、調查，MO在秋末春初氣候寒冷多變的季節(jié)多發(fā)，陽性檢出率為24．1％。分離到的6株支原體野生株，通過生化特性、菌落形態(tài)、返祖試驗、生長抑制試驗和代謝抑制試驗等鑒定認為它們是綿羊肺炎支原體菌株。MO對羊的主要侵害器官為肺臟，通過組織切片HE染色觀察，發(fā)現(xiàn)在氣管和支氣管周圍以及肺泡內有大量單核細胞聚集。MO是山羊和綿羊呼吸道感染常見病原體之一，在世界上多個國家地區(qū)普遍流行，造成巨大經(jīng)濟損失。因此，尋找快速準確診斷MO的方法以便于早診斷、早治療，對于減少損失是必要的。分離培養(yǎng)方法耗時、困難，特別是對于難培養(yǎng)的支

4、原體；血清學診斷方法也是支原體感染通常使用的方法，然而種間的交叉反應，非特異性反應的存在，極大阻礙了血清學方法的應用。此外，鑒定支原體分離株需要對應的特異的高免血清，而這些血清是不易得到的。PCR的方法克服了這些缺點，它已經(jīng)成為～種非常有效的檢測微生物的方法。本次試驗根據(jù)MO的標準株Y98的16SrRNA基因兩端的保守區(qū)設計一對引物(ZW-5’和ZW-3’)用于PCR法快速診斷MO，同時用肺炎支原體(Mycoplasmapneumoniae，下稱Mp)FH株、M．Myc．sub．Myc．標準株Y—goa

5、t、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作對照，通過PCR可以明顯的區(qū)分出這這幾種病原體，并可擴增出MO的分離株HD一1。本試驗采用兩種方法制各PCR模板：常規(guī)制各DNA法和煮菌法。兩種方法進行PCR都得到滿意的結果。用煮菌法進行支原體的PCR檢測在國內報道中未見先例，試驗證明煮菌法操作簡便、經(jīng)濟的方法，比提取DNA作為模板進行PCR更適用于臨床檢測。用煮菌法進行臨床標本檢測，52份疑為綿羊肺炎支原體感染的臨床標本，同時用支原體分離培養(yǎng)法作對照。結果用培養(yǎng)法有6份鑒別培養(yǎng)基由紅色變?yōu)辄S色，為陽性：PCR檢測有14份

6、為陽性結果。PCR方法克服了血清方法存在的交叉反應的弊端，而且特異性強，敏感性高，是支原體診斷的一種可靠的診斷方法。關鍵詞：綿羊肺炎支原體；微生物學特性；聚合酶鏈式反應(PCR)獨創(chuàng)性聲明本人聲明所星交的學位論文是本人在導師指導下進行的研究工作及取得的研究成果．據(jù)我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得通：!望塾醚或其他教育機構的學位或證書而使用過的材料．與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示謝意．學位論文

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