聚乙二醇交聯(lián)制備透明質(zhì)酸衍生物的方法及其性能研究

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1、摘要摘要透明質(zhì)酸是生物體內(nèi)普遍存在的一種線性粘多糖物質(zhì)，已被廣泛運(yùn)用于關(guān)節(jié)疾病治療和眼科手術(shù)等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中。然而，由于天然透明質(zhì)酸在體內(nèi)存留的時間較短，大大限制了其療效的發(fā)揮，尤其是近年來在預(yù)防粘連和軟組織填充等方面的應(yīng)用，要求透明質(zhì)酸在體內(nèi)應(yīng)具有適宜的存留時間，有時甚至要求在體內(nèi)長期存留，由此激發(fā)了研究者對天然透明質(zhì)酸結(jié)構(gòu)改造工作的興趣。對透明質(zhì)酸的化學(xué)修飾研究工作可追溯至60年前，將透明質(zhì)酸制成衍生物應(yīng)用于臨床上的研是由Balazs等首先開始的。透明質(zhì)酸分子中的四個部分—羥基、N一乙酰氨基、羧基和還原末端均可被化學(xué)修飾，但目前報(bào)道的衍生物的制備多為對其羥基和羧基進(jìn)行的研究工作

2、。本文的研究重點(diǎn)：參照聚乙二醇修飾蛋白質(zhì)的反應(yīng)機(jī)理，利用聚乙二醇對透明質(zhì)酸上的N一乙酰氨基進(jìn)行化學(xué)修飾，研究所得到的衍生物的各種材料學(xué)性能和生物學(xué)性能。實(shí)驗(yàn)路線：首先利用碳二亞胺、乙二酸二酰肼和聚乙二醇三種不同的交聯(lián)試劑對透明質(zhì)酸進(jìn)行化學(xué)修飾，對三種衍生物的結(jié)構(gòu)、溶脹性和特性粘度進(jìn)行比較，分析不同交聯(lián)劑修飾得到的衍生物的特點(diǎn)及其各種交聯(lián)劑本身的優(yōu)點(diǎn)和劣勢；其次主要對聚乙二醇修飾透明質(zhì)酸上的N一乙酰氨基所得到的衍生物的分子量、結(jié)構(gòu)、流變學(xué)性能、細(xì)胞毒性和生物降解性進(jìn)行測試研究。本論文的主要研究內(nèi)容如下(1)利用紅外光譜和拉曼光譜對三種衍生物的反應(yīng)機(jī)理進(jìn)行分析和確認(rèn)，可證實(shí)HA-E

3、DC、HA—ADH的交聯(lián)是通過HA中羧基與EDC、ADH進(jìn)行反應(yīng)的，而在堿性條件下活化的PEG與HA上的N．乙酰氨基發(fā)生酯化反應(yīng)。在本試驗(yàn)條件下，反應(yīng)2h交聯(lián)反應(yīng)的交聯(lián)度可以根據(jù)交聯(lián)劑的用量、反應(yīng)條件(反應(yīng)時間、pH值等)加以控制。在溶脹性試驗(yàn)中，衍生物的溶脹度均在5-61之間，具有很好的保水性。在堿溶液中HA-EDC產(chǎn)物發(fā)生降解，并且降解程度大于m原粉；HA—ADH產(chǎn)物不溶于堿性溶液，說明在堿性條件下其抗降解性能良好；HA—PEG衍生物在堿溶液中的抗降解性大于HA原粉的抗降解性。(2)本實(shí)驗(yàn)中利用活化的PEG在室溫條件下與姒發(fā)生反應(yīng)。對活化PEG反應(yīng)而言，利用紅外光譜和拉曼光

4、譜證實(shí)其反應(yīng)確已發(fā)生，并研究在有無催化劑、不同反應(yīng)時間和不同反應(yīng)溫度下PEG被酯化的轉(zhuǎn)化率的大小，從而選定活化PEG的最佳反應(yīng)條件，即在吡啶催化作用下，100℃，反應(yīng)4h為其最佳反應(yīng)條件。(3)本試驗(yàn)利用膜滲透法計(jì)算HA-PEG衍生物和HA原粉的數(shù)均分子量。通過計(jì)算可知：HA衍生物的數(shù)均分子量值均小于HA原粉的數(shù)均分子量值；反應(yīng)12h摘要得到的衍生物的分子量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于反應(yīng)18h時得到的衍生物的分子量。已知本實(shí)驗(yàn)所用HA原粉的Mw為1．54x106，而計(jì)算所得HA的Mn分子量為88．58x104，究其原因：因?yàn)镸。

5、誤差。(4)透明質(zhì)酸的結(jié)構(gòu)對其流變學(xué)性能和生物學(xué)性能有重要的影響，直接決定它在臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用效果和發(fā)展前途。通過掃描電鏡觀測可知HA—PEG衍生物保持著交聯(lián)形態(tài)，分子聚集成長的細(xì)絲，相互纏繞，進(jìn)而再分枝構(gòu)成不規(guī)則的蜂巢狀，且其相對致密度較高；利用圓二色譜進(jìn)一步證實(shí)HA．PE具有螺旋構(gòu)象、折疊構(gòu)象、轉(zhuǎn)角和隨機(jī)結(jié)構(gòu)等二級結(jié)構(gòu)構(gòu)型和網(wǎng)狀三級結(jié)構(gòu)構(gòu)型。(5)在HA—PEG衍生物流變學(xué)性能研究中，首先對不同反應(yīng)時間(6h、12h、18h和24h)、不同PEG分子量(400、6000、20000)及不同PEG／HA摩爾比(1／10、1／5、1／3、1／2)所得到的衍生物的特性粘度和動力

6、粘度進(jìn)行測試，并從反應(yīng)交聯(lián)度和分子結(jié)構(gòu)角度對其測試結(jié)果進(jìn)行分析討論；其次研究了衍生物的粘度和剪切速率以及彈性模量和粘性模量之間的關(guān)系，以及粘性溶液與彈性體之間的轉(zhuǎn)換關(guān)系。當(dāng)PEGMr6000，PEG／HA=1／10時，反應(yīng)12h時，姒-PEG衍生物的特性粘度最大；當(dāng)PEG／HA=1／lo，反應(yīng)18h時，隨著PEG分子量的增大，衍生物的特性粘度減小，但其動力粘度卻增大；HA—PEG溶液是標(biāo)準(zhǔn)的假塑性非牛頓流體，溶液的粘度與其質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈正相關(guān)系，粘度和彈性與溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)也成正比關(guān)系；溶液由低振蕩頻率向高振蕩頻率轉(zhuǎn)換的同時也由粘性體向彈性體的轉(zhuǎn)換；且隨著溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，交叉點(diǎn)頻率

7、逐漸降低，使溶液的彈性特征增強(qiáng)。(6)在細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中，利用倒置相差顯微鏡觀察各組細(xì)胞在培養(yǎng)1d、2d、4d、6d、8d和10d時細(xì)胞生長形態(tài)及細(xì)胞增殖率變化可知，隨著時間的延長，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞進(jìn)一步生長，分化和增殖，細(xì)胞數(shù)量逐漸增加，細(xì)胞生長形態(tài)正常，貼壁生長良好。細(xì)胞毒性分別均為1級，總體評級為1級，細(xì)胞平均增殖率為95．49％，完全符合生物材料的應(yīng)用要求。初步研究證實(shí)，以PEG作為交聯(lián)劑交聯(lián)制備的HA衍生物材料的細(xì)胞相容性較好。(7)三種不同摩爾比所制備的HA衍生物薄膜在磷酸鹽緩沖溶液中浸