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1、揚(yáng)州大學(xué)碩士學(xué)位論文雞傳染性貧血檢測(cè)方法的建立及雞傳染性貧血病毒海安株致病性研究姓名：王平平申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師：秦愛(ài)建20100501揚(yáng)州大學(xué)碩士學(xué)位論文2雞傳染性貧血檢測(cè)方法的建立及雞傳染性貧血病毒海安株致病性研究研究生：王平平導(dǎo)師：秦愛(ài)建教授中文摘要摘要：雞傳染性貧血病毒(CAV)是一種獨(dú)特的環(huán)狀單鏈(負(fù)鏈)無(wú)囊膜DNA病毒，該病毒廣泛存在于世界所有家禽生產(chǎn)國(guó)家，是青年雞群發(fā)生傳染性貧血綜合癥的病因。CAV感染后可導(dǎo)致再生障礙性貧血及全身淋巴組織萎縮，并伴隨嚴(yán)重的免疫抑制，
2、常繼發(fā)病毒、細(xì)菌及真菌性感染，成為危害養(yǎng)禽業(yè)的主要病原體之一。因此，CAV診斷的標(biāo)準(zhǔn)化工作顯得十分重要。1．雞傳染性貧血檢測(cè)方法的建立本研究參照GenBank發(fā)表的CAVCux．1序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，對(duì)感染MSBl細(xì)胞中的CAV進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增，對(duì)影響擴(kuò)增的各個(gè)條件進(jìn)行了優(yōu)化。試驗(yàn)結(jié)果表明PCR方法可以從陽(yáng)性CAV病料中擴(kuò)增出長(zhǎng)度為580bp的特異片段，特異性試驗(yàn)證明，該方法不能擴(kuò)增ALV、REV、MDV、NDV等基因組核酸，而只能擴(kuò)增CAV基因組核酸，顯示其具有較好的特異性；敏感性試驗(yàn)
3、結(jié)果表明，建立的PCR方法最低可以檢測(cè)到3．98個(gè)TCID50的病毒，形成了CAV檢測(cè)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)上報(bào)稿。隨機(jī)抽取9份市場(chǎng)疫苗，用建立的PCR方法檢測(cè)CAV污染情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2份陽(yáng)性，提示市場(chǎng)疫苗的質(zhì)量不容忽視。以感染CAV海安株的MSBl細(xì)胞為抗原，固定于玻片上，以CAV免疫SPF雞的多抗血清作為一抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記的兔抗雞IgG抗體為二抗，建立了檢測(cè)CAV抗體的IFA方法。研究結(jié)果表明，感染CAV的MSBl細(xì)胞只與CAV多抗反應(yīng)，與ALV、NDV、AE、IBDV多抗均不反應(yīng)，證明該檢測(cè)方法具有較好的特異
4、性；敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該方法較中和試驗(yàn)敏感性低。2．雞傳染性貧血病毒海安株致病性研究將64只1日齡SPF雞隨機(jī)分為攻毒組(32只)及對(duì)照組(32只)，攻毒組每只雞胸王平平：雞傳染性貧血病毒檢測(cè)方法的建立及雞傳染性貧血病毒海安株致病性研究部肌肉接種2009LCAV海安株病毒懸液(TCID50=1046／50pL)，對(duì)照組接種等量1640培養(yǎng)基。結(jié)果接種病毒雛雞呈現(xiàn)特征性的臨床癥狀(貧血)，并伴有精神沉郁、食欲減退、羽毛蓬松等癥狀，第16天癥狀最顯著并出現(xiàn)死亡，20天后逐漸恢復(fù)。分別于接種病毒后第4、8、
5、12、16、20、24、28天撲殺雛雞，采集胸腺、心臟、肝臟、脾臟、腎臟、法氏囊、骨髓、胰臟等組織，準(zhǔn)確稱重胸腺、肝臟、脾臟和法氏囊并進(jìn)行組織切片觀察，用PCR方法檢測(cè)不同階段病毒在各組織中分布情況。結(jié)果表明，雛雞攻毒后12至16天，胸腺、法氏囊生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制，脾臟指數(shù)無(wú)明顯變化，肝臟則較對(duì)照組腫脹；組織切片結(jié)果顯示，第8．16天可在胸腺、脾臟組織切片內(nèi)觀察到嚴(yán)重的淋巴細(xì)胞缺如，肝臟則表現(xiàn)出細(xì)胞腫脹、肝竇間隙擴(kuò)張等病理變化，法氏囊淋巴細(xì)胞缺如不顯著。PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，肝臟和胸腺中病毒滴度均在攻毒后
6、第16天達(dá)到最高，從第4天至28天在雞的心、肝、法氏囊、骨髓中均可檢測(cè)到病毒，胸腺和脾臟攻毒后24天內(nèi)PCR均為陽(yáng)性，隨后檢出率降低；腎臟攻毒后16天內(nèi)PCR均為陽(yáng)性，隨后檢出率逐漸降低。血清中病毒檢出率從攻毒后4天開(kāi)始逐漸升高，12天到達(dá)高峰，在20天時(shí)不能被檢出。IFA抗體檢測(cè)結(jié)果顯示，攻毒后至第24天可檢測(cè)到抗體，少量CAV感染細(xì)胞出現(xiàn)特異性熒光，但28天開(kāi)始CAV感染細(xì)胞呈現(xiàn)大量特異性熒光，32天呈現(xiàn)強(qiáng)熒光；病毒中和試驗(yàn)(VN)檢測(cè)雛雞血清中和抗體水平結(jié)果顯示，攻毒后第16天可從血清中檢測(cè)到低
7、滴度的抗體(1：32．1：64)，第28天抗體滴度上升(1：512．1：1024)，第32天產(chǎn)生較高滴度中和抗體(>1：1024)。綜上所述，本研究建立的雞傳染性貧血PCR和IFA診斷方法具有較好的特異性和靈敏性，并且具有快速、簡(jiǎn)便、成本低等優(yōu)點(diǎn)，可用于雞傳染性貧血快速診斷和流行病學(xué)調(diào)查。CAV海安株致病性實(shí)驗(yàn)表明，雛雞感染后呈現(xiàn)特異性的免疫器官抑制，攻毒后第4天至28天幾乎所有組織均可用PCR方法檢測(cè)到病毒，而第16天時(shí)臨床癥狀、病理變化及組織中病毒滴度均達(dá)到最高峰，隨后逐漸恢復(fù)。CAV抗體水平在感
8、染病毒后28天內(nèi)逐步上升，但感染早期血清中低滴度的抗體只有通過(guò)VN才能檢測(cè)到，IFA檢測(cè)靈敏性較VN實(shí)驗(yàn)低。關(guān)鍵詞：雞傳染性貧血病毒；致病性；PCR：IFA；VN實(shí)驗(yàn)；診斷揚(yáng)州大學(xué)碩士學(xué)位論文4Developmentofdiagnostictechniques一'●l■^·■●110rCllicKeninlectionsanemlaandpathogenicityofHaianstrainCandidate：PingpingWangSupervisor：
