絲狀真菌組織DNA的提取

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1、維普資訊http://www.cqvip.com生物技術(shù)9(6)：38—41，1999Bioteehrmlc~絲狀真菌組織DNA的提取韓利剛袁毅王罡第二軍醫(yī)大學(xué)南京軍醫(yī)學(xué)院席原學(xué)教研室。南京．210099)(解斂軍墩牧大學(xué)裹學(xué)系，長謇．130062)用CrAB法直接從熊收真茵的新鮮茵籃中提取DNA，井將所提取DNA進行隨機引糟多態(tài)性擴增(RAPD)，得到了較清晰的擴增圖譜，證明誼法為提取真茵DNA以用于分子生物學(xué)研究的一種有效方法。關(guān)鍵詞：DNA提取，絲狀真茼，褂D法站見呈諸要報道，如種Cr提AB取法及氯化芐法等?1。1材料與方法各種

2、方法因所提DNA的用途不同而各異，1．1材料但基本原理一樣。由于D】A分子量較太，1．1．1供試菌種：共2屬8種l1個菌株，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，提取過程易降癬、變性，我們在參中l(wèi)O種來自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所考前人工作基礎(chǔ)上建立了一種適合絲狀真菌(ID)，1種由本室分離培養(yǎng)。詳見表1。DNA提取的較為簡便、易行、可靠的方法。裹】RAPD研究供試一種／洼：D為中國壓學(xué)科學(xué)院皮膚霸研究所1．1．2主要試劑：2×CTAB緩沖液t2％7MNaC[；CrAB沉淀緩沖液：1％CRAB(w／CTAB(w／w)+100mMTris(pH8．0)+1．4M

3、+50mMTris(pH8．0)+10mMEDTANaCI5％CTAB溶液：5％CTAB(w／w)+0．(pH8．0)；高鹽TE緩沖液；10mMTris(pH8．0)+lmMEDTA(pH8．0)+1MNaCl；1×TE緩沖液；10mMT出(口H8．0)+lmM收稿日期：1999—02—10．慘回日期}1999—0B一07ED'rA(!al8．0)；95％乙醇；80％乙醇；氯仿／異戊醇混合液：24：1(v／v)(4℃貯存)；液氟；維普資訊http://www.cqvip.com生物技術(shù)9(6)：38～41，1999Bioteckdog

4、y引物，購白上海細胞所癌基因研究室；Taq30s。如溶液其呈微弱的云霧狀或溶液依舊酶，購白中國科學(xué)院遺傳所。很清，剛產(chǎn)量低，需離心1—5rain。棄去上清1．1．3主要儀器：日本MDEL7930型高速液。將片狀l沉淀在高鹽TE緩沖液中溶解。冷凍離心機；．rD236型PCR儀；電泳儀c加入20xTE緩沖液溶解小的片狀沉淀，1．2方法50ul溶解中等片狀沉淀，100gl溶解大的片1．2．1樣品處理：將供試菌種接種于PDA狀沉淀。65℃水潛5rain，用手輕彈以溶解片平板，置25℃恒溫籍中培養(yǎng)約4周。用無菌狀沉淀。如果片狀沉淀不能完全溶解，

5、可加接種針在平板上挑取約lg新鮮茁絲至一干入更多的高鹽TE緩沖液。加入總量不要超凈研缽中。盡量避免挑到培養(yǎng)基。在研缽中過500。如還不能完全溶解，移出上清液。飼人液巍。用研桿將菌體組織／液氮混合物加入2倍體積的95％冷乙醇至上清液中，輕迅速充分研磨。將研磨后的茵體組織／蒗氮輕混合。離心5rain，如無沉淀，離心的時間混合物粉末移至一微型離心管(1000)中。可長一些。棄去上清液。加入一個體積的80％乙醇，混合并離心3—5rain，棄去上清液。在干燥器中干燥20—30rain，直至所有的液體都蒸枯完。在1X，IE中重新溶鏘片狀沉淀。小量

6、沉淀加入20gl，中等沉淀加入50，大的沉淀或更多時，加入100~I。08％凝膠電泳檢測。置一20℃下保存。1．2．3In濃度測定：姒—DNA為標(biāo)準(zhǔn)。以瓊脂糖凝腔電泳方式進行對其濃度測定。制備較薄的0．8％瓊脂糖凝腔。剪取一條Parafilrn包裝膜．在無菌干凈的一面．按所需要的點樣個數(shù)在上面順序點加Loading田111十曹糠的DNA皂諫圈【左一為江(O．2ug)lbu{fe~各1滴(約2)。制備—DNA濃度崔：備加樣孔的加樣■序見表1如不馬上提取，可貯存于一舯℃冰箱。標(biāo)準(zhǔn)梯度，取公司標(biāo)準(zhǔn)濃度—DNA(0．38,ugI)，分別向上步

7、滴加的LB上逐個1．2．2DNA提取：在離心管加入65℃加入0．2,u．g、0．4g、0．6g。點樣所提樣品CAB緩沖液，體積與離心管內(nèi)物質(zhì)體積近DNA各1，按順序點在上步不同LB滴上。似相等(約400~1左右)。將離心管置于65℃記下位置，用吸頭輕輕吸打混勻，然后小心加水浴lrnin。如水浴后混合物呈膠粘濕滑狀。入膠槽中進行電泳。在溴酚藍帶達到膠槽的則將離心管繼續(xù)置于65℃水浴至少3—5rain1／'3處，停止電泳。將膠放人0．5gg／rnl溴化(長可至20n)。加入1個體積(等于管內(nèi)乙錠中染色5—10mln，在清水中浸泡lmin，

8、內(nèi)含物當(dāng)前總體積)的氯仿／異戊醇混臺液。在紫外光下觀察并記錄結(jié)果。徹底混合形成完全的乳濁液。1l，000g離心I．24兔：以所提絲狀真菌的DNA為3os。轉(zhuǎn)移上清液至一新微型管中，加入1／5模板，進行乳'D擴增。體積的5