《抗原抗體的純化》PPT課件

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1、免疫學(xué)檢驗(yàn)?掌握各種純化方法的原理?熟悉各種純化方法的影響因素?了解各種純化方法的技術(shù)要點(diǎn)2p免疫學(xué)檢驗(yàn)最重要的元素為抗原、抗體和免疫細(xì)胞p免疫學(xué)檢驗(yàn)最核心的部分為抗原抗體反應(yīng)(Antigen-antibodyinteraction)p抗原、抗體是免疫反應(yīng)中最基本的物質(zhì)因素34p抗原的純化是制備高效價(jià)、高特異性抗體的先決條件p抗體的純化對(duì)提高免疫反應(yīng)的特異性和敏感性、定量檢測(cè)抗原極為重要。5表3-1分離純化方法的比較原理優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)應(yīng)用方法離心力和物離心分離法質(zhì)沉降系操作簡(jiǎn)單分辨率低蛋白質(zhì)分離數(shù)的差別操作簡(jiǎn)單，成本低，分辨率低，純化蛋白質(zhì)的分級(jí)沉鹽析法鹽析作用重復(fù)性較

2、好倍數(shù)低淀脫水作用和對(duì)蛋白質(zhì)有變性蛋白質(zhì)、多肽、有機(jī)溶劑沉淀操作簡(jiǎn)單，分辨力降低介電作用，成本核酸和多糖法較強(qiáng)常數(shù)較高的分級(jí)沉淀分子質(zhì)量有差別分子篩的排分辨力強(qiáng)，不引起凝膠層析法成本高的可溶性物阻作用蛋白質(zhì)變性質(zhì)離子基團(tuán)的分辨力強(qiáng)，分離量費(fèi)時(shí)間，酸堿用可電離的生化物離子交換法交換作用大量大質(zhì)分離物與配一種配體只分離親和層析法體間的親分辨力很強(qiáng)一類(lèi)物質(zhì)，生命大分子物質(zhì)和作用局限性大物質(zhì)的帶電設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方生物分子的分離、電泳成本高性質(zhì)便、分辨率高定性、定量2021-8-2466離心分離已成為科學(xué)研究中最基本的技術(shù)7一、基本原理?離心法是利用旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)的離心力、物質(zhì)的

3、沉降系數(shù)和浮力密度的差別進(jìn)行分離的技術(shù)，當(dāng)物質(zhì)的粒子以一定角速度做圓周運(yùn)動(dòng)時(shí)，受到一個(gè)外向的離心力。（一）離心力?這種力的大小取決于角速度（，弧度/）和旋轉(zhuǎn)半徑，方程式為：2??2?N?F?mr??mr????60?l式中：：沉降固體顆粒的有效質(zhì)量（m）；l：離心半徑，轉(zhuǎn)子中心軸到沉降顆粒之間的距離(r)；l：離心機(jī)每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)（N）。2021-8-2488（二）沉降系數(shù)?受離心力作用的分子或顆粒，單位時(shí)間內(nèi)運(yùn)動(dòng)的距離稱(chēng)沉降速度。單位離心力作用下的沉降速度稱(chēng)沉降系數(shù)，用s表示。?絕大多數(shù)生物分子的沉降系數(shù)都很小，將s乘1013定義為一個(gè)沉降系數(shù)單位，用S（Sved

4、berg）表示，?一般S為20℃的純水中待測(cè)物質(zhì)的沉降系數(shù)。213d(???)10S?18?式中：d：沉降顆粒直徑；δ：沉降顆粒密度；ρ：溶劑液體密度；η：溶劑液體黏度；2021-8-2499?（一）差速離心（differentialcentrifugation）是指采用不同的離心速度和離心時(shí)間，用不同的離心力，使不同沉降速度的顆粒分批分離的方法。?差速離心主要用于分離大小和密度差異較大的顆粒。1011?差速離心法分離到的某一沉降物，純度不高，含有較多雜質(zhì)。?需在沉淀中加入相同介質(zhì)使沉淀懸浮，再用較低轉(zhuǎn)速離心，獲得較純的沉淀。?反復(fù)多次采用高速、低速離心操作，即可

5、獲得較純的組分。12優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單、方便；缺點(diǎn)：①分離效果較差，費(fèi)時(shí)，不能一次得到純品；②管壁效應(yīng)嚴(yán)重，特別當(dāng)顆粒很大或濃度很高時(shí)，沉淀出現(xiàn)在離心管壁一側(cè)；③顆粒被擠壓，離心力過(guò)大和離心時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，都會(huì)使顆粒變形、聚集而失活。13?（densitygradientcentrifugation）是樣品在密度梯度介質(zhì)中進(jìn)行離心，適于分離密度相近而大小不同的物質(zhì)。?（isopycnicgradientcentrifugation）適于分離大小相同而密度不同的物質(zhì)。14三、影響因素p離心機(jī)的種類(lèi)、離心方法、離心介質(zhì)以及密度梯度p（一）離心速度?低速離心一般用離心速度，即轉(zhuǎn)子

6、每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)表示，如5000r/min等。?高速離心和超速離心時(shí)，往往以相對(duì)離心力（RCF）表示，如60000×g等。?相對(duì)離心力是指顆粒所受到的離心力與地心引力之比值。即：Fc?52RCF??1.12?10?n?rFg2021-8-241515p依據(jù)離心方法的不同，離心時(shí)間的概念也有差別。?常速離心、高速離心和差速離心的離心時(shí)間，是指顆粒從離心管中樣品液的液面完全沉降到管底的時(shí)間，即沉降時(shí)間；?密度梯度離心的離心時(shí)間，是指形成界限分明的區(qū)帶時(shí)間，即區(qū)帶形成時(shí)間；等密度梯度離心所需的離心時(shí)間，是指顆粒完全到達(dá)等密度點(diǎn)的平衡時(shí)間，即平衡時(shí)間。p離心時(shí)間時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短

7、，都會(huì)影響顆粒在離心管內(nèi)的預(yù)期位置，降低分離效果。16?為防止欲分離物質(zhì)在離心過(guò)程中的聚集、變形和失活，離心溫度一般控制在4℃左右。?離心速度較低或者物質(zhì)的耐熱性較好，也可以在室溫條件下進(jìn)行。?超速離心和高速離心，轉(zhuǎn)子高速旋轉(zhuǎn)會(huì)發(fā)熱而引起溫度升高，必須采用冷凍系統(tǒng)。17?離心介質(zhì)的pH必須是處于待分離物質(zhì)穩(wěn)定的pH范圍內(nèi)，必要時(shí)可用緩沖溶液。?pH過(guò)高或過(guò)低都可能引起生物活性物質(zhì)的變形、失活，還可能引起轉(zhuǎn)子和離心機(jī)其它部件的腐蝕，應(yīng)加以注意。18?生物大分子的分離、濃縮和純化19?通過(guò)改變?nèi)芤旱臈l件或添加某種物質(zhì)，降低溶液中某一成分的溶解度，使其從溶液中沉淀析出，

8、與其它成分