《電泳技術劉蕓》PPT課件

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1、第七章電泳技術Electrophoresis分析測試中心劉蕓1內(nèi)容提綱紙電泳凝膠電泳等電聚焦電泳雙向電泳電泳技術（DIGE）毛細管技術電泳技術概論3132常用電泳技術2一、定義電泳：帶電粒子在直流電場中向著與其本身所帶電荷電性相反的電極移動的現(xiàn)象。電泳技術：生物樣品在電泳過程中因各組分的移動快慢不同而被分離的技術。利用電泳現(xiàn)象進行物質分離的技術。第一節(jié)電泳技術概論34二、電泳分析技術發(fā)展概況1809年發(fā)現(xiàn)電泳現(xiàn)象1937年Tiselius自由界面電泳1948年Wieland濾紙電泳1959年聚丙烯酰胺凝膠電泳198

2、0’s毛細管電泳(capiliaryelectrophoresis)ArneWilhelmKaurinTiselius蒂塞利烏斯(瑞典人)因研究電泳和吸附分析，特別是發(fā)現(xiàn)關于血清蛋白的復雜本質而獲獎19485三、電泳分析技術的分類1.根據(jù)被分離樣品的量多少分析電泳制備電泳2.根據(jù)電泳電壓的高低常壓電泳100～500V高壓電泳500～10kV6①濾紙及其他纖維薄膜電泳，如醋酸纖維素、玻璃纖維、聚氯乙烯纖維②凝膠電泳，如瓊脂、瓊脂糖、硅膠、淀粉膠、聚丙烯酰胺凝膠電泳③粉末電泳，如纖維素粉、淀粉、玻璃粉電泳④絲狀電泳，如

3、尼龍絲、人造絲電泳3.根據(jù)電泳中是否使用支持物自由電泳—不使用支持物，在溶液中進行。區(qū)帶電泳—使用支持物(1)按支持物的物理性狀不同，可分為7(2)按支持物的裝置形式不同，可分為平板式電泳垂直板式電泳垂直柱式電泳891011121314連續(xù)pH電泳—指電泳過程中pH保持不變，如濾紙電泳、醋纖膜電泳。不連續(xù)pH電泳—指電極緩沖液和電泳支持物的不同區(qū)段有不同的pH，如PAGE、IFE。優(yōu)點：在不同pH區(qū)之間形成高的電位梯度區(qū)，使蛋白質移動加速壓縮為一極狹的區(qū)帶而達到濃縮的目的。4.根據(jù)電泳系統(tǒng)pH是否連續(xù)，可分為15四

4、、電泳技術的特點凡是帶電物質均可應用某一電泳技術進行分離,并可進行定性或定量分析;樣品用量極少;設備簡單;可在常溫進行;操作簡便省時;分辨率高.16五、電泳技術應用臨床診斷進行血清蛋白、血紅蛋白、精蛋白、脂蛋白的分離、鑒定和含量測定以及血清學酶的檢驗、免疫化學檢驗等。工業(yè)制造用于提純酶、激素及其它生化產(chǎn)品基礎理論研究從分離與分析無機離子到復雜的生物高分子化合物，以及在放射化學和免疫化學中都占有重要的地位；在各類電泳技術中，尤以凝膠電泳在分離分析酶、蛋白質、核酸等生物大分子等方面分辨力為最高，為生物化學，分子生物學的

5、發(fā)展作出了重大貢獻。17六、電泳的基本原理懸浮或溶解在電解質溶液中的帶電粒子，在電場作用下以不同的速度向著與自身所帶電荷極性相反的電極移動。在電泳過程中，帶正電荷的粒子向電場的負極方向移動，帶負電荷的粒子向電場的正極方向移動。移動的帶電粒子受到電場力和周圍介質阻力的作用，當二力平衡時，粒子以穩(wěn)定的速度向電極方向移動。由于電荷、質量等的差異，粒子將會有不同的質/荷比，使其在電場中具有不同的遷移速度。18以蛋白質分子為例:（q：有效電荷，E：場強）F=Eq電場力：F’=6?r?v（F’：摩擦阻力，v：在介質粘度η中半徑

6、為r的顆粒的移動速度）阻力：19VqM=———=————E6?r?Eqv=————6?r?Eq=6?r?vF=F’遷移率（Mobility)——帶電顆粒在單位電場強度下的泳動速度。20七、影響電泳速度的因素1.電場強度（E）E↑→電流↑→熱效應→支持介質上的水分蒸發(fā)→樣品的熱變性E↓→電泳速度慢→延長電泳時間→樣品擴散→區(qū)帶模糊不清→分辨率下降常壓電泳100～500V1V/cm~10V/cm高壓電泳500～10kV20V/cm~200V/cm21溶液的I越高，質點的泳動速度越慢，但區(qū)帶分離度卻較清晰。I↑→緩沖能力

7、越大→緩沖液所載的分電流增加，而樣品所載的電流相應減少→電泳速度減慢2.離子強度（I）（m：離子的摩爾濃度，Z：離子的價數(shù)）對于稀溶液：22pH值決定了化合物解離的程度，也決定了物質所帶的凈電荷。3.緩沖液的pH23氨基酸的兩性解離性質及等電點（pI）pH=pI凈電荷=0pHpI凈電荷為負NH2CHRCOOHNH3+CHRCOOCHRCOONH3++H++OH-+H++OH-(pK′1)(pK′2)等電點(isoelctricpoint)：當氨基酸溶液在某一定pH值時，使某特定氨基酸分子上所帶

8、正負電荷相等，成為兩性離子，在電場中既不向陽極也不向陰極移動，此時溶液的pH值。24---------------+++++++++——————————+++++++++（液）---------------負極←→正極4.電滲效應電滲（electro-osmosis）——指在電場作用下液體相對于固體支持物的相對移動。255.分子篩在凝膠電泳中，分離蛋白質等物