海藻酸鈉降解菌株的篩選

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1、海藻酸鈉降解菌株的篩選指導教師：姚子昂教授答辯人：許媛麗答辯內容研究背景選題依據(jù)和意義實驗材料實驗方法分析討論致謝研究背景海藻酸鈉---又名褐藻酸鈉、褐藻膠，是一種來源于海洋褐藻的陰離子酸性多糖，是海帶中提取的由α-L-1,4古羅糖醛酸(G)及β-D-1,4甘露糖醛酸(M)隨機組合形成的線性高分子量聚合物，廣泛應用于食品、醫(yī)藥等方面。研究背景由于海藻酸鈉具有凝膠性強，粘度大，水溶性較差，不容易被吸收等特點，限制了海藻酸鈉許多其他方面的應用，所以具有多種生理活性的褐藻膠多糖降解產(chǎn)物---褐藻膠寡糖(AlginateOligos

2、accharides，AOS)逐漸進入人們的視野。研究背景褐藻膠寡糖是一類新型生物制劑，具有可自然降解、不污染環(huán)境和無殘留等優(yōu)點。近年來，通過對褐藻膠寡糖生物活性的研究發(fā)現(xiàn)：褐藻膠寡糖具有整腸和解毒、降血糖血脂、抗凝血、抗炎、免疫調節(jié)等作用。因此通過各種降解方法制備的褐藻膠寡糖在糖化學、糖生物學、糖工程及糖類藥物研究領域具重要的研究價值。選題依據(jù)和意義目前褐藻膠寡糖的獲取方法主要應用酶解法，它是一種條件溫和、可控性強和特異性高的生物降解方法,在寡糖制備各方面明顯優(yōu)于化學和物理降解。選題依據(jù)和意義本實驗利用微生物作用于海藻酸鈉

3、得到降解酶并最終獲得寡糖，通過誘導篩選出產(chǎn)酶量高、酶活性強的優(yōu)勢菌株，測定其生長曲線和酶活曲線,對其發(fā)酵條件進行優(yōu)化研究。為大規(guī)模生產(chǎn)海藻酸鈉裂解酶奠定理論基礎，對海藻膠寡糖的應用具有推動作用，并且對進一步研究海洋寡糖提供研究方向。實驗材料腐爛的海帶，取自大連開發(fā)區(qū)海貝廣場海域實驗方法一.篩選菌株1樣品的處理用無菌生理鹽水系列稀釋海帶樣品，取合適濃度涂布，30℃，恒溫培養(yǎng)72h。2初篩以海藻酸鈉作為唯一碳源分離和篩選海藻酸鈉降解菌，30℃恒溫培養(yǎng)72h。3復篩將初篩得到菌株先接到斜面培養(yǎng)基活化，再挑取2環(huán)接入復篩培養(yǎng)基中30

4、℃，150r/min，培養(yǎng)24h，再進行測定。二.測定高產(chǎn)菌株生長曲線和酶活曲線1.生長曲線測定每隔3h從種子液中取樣按比濁法測定種子液的生物量（以OD540nm表示）。2.酶活曲線測定采用DNS法，1ml粗酶液和1ml海藻酸鈉底物40℃反應30min，加入2mlDNS沸水浴3min，冷卻，測540nm處OD值。實驗方法三.產(chǎn)酶條件的研究1.碳源種類發(fā)酵培養(yǎng)基分別以瓊膠、淀粉、海藻酸鈉和卡拉膠作為唯一碳源，濃度為0.2%，其他物質含量不變。2.碳源濃度在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加濃度為0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9

5、%的海藻酸鈉，其他物質含量不變。3.氯化鈉濃度在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加濃度為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%的氯化鈉，接其他物質含量不變。實驗方法4.pH在發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別按6.0、6.4、6.8、7.2、7.6調節(jié)培養(yǎng)基的pH，接其他物質含量不變。5.蛋白胨濃度在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加濃度為0.1%、0.3%、0.5%和0.7%的蛋白胨，接其他物質含量不變。實驗結果---菌株篩選本實驗初篩后分離得到10多株能夠產(chǎn)海藻膠裂解酶的細菌，通過比較菌落周圍透明圈與菌落的直徑比值以及透明圈的透明度，選擇菌株11為后期的

6、實驗菌。實驗結果---生長曲線和酶活曲線由圖可以看出，菌株11在3h后開始進入對數(shù)生長期，并于30h達到最大生物量。隨后，隨培養(yǎng)時間延長，該菌很快開始衰亡。實驗結果---生長曲線和酶活曲線由圖4可以看出，菌株11的酶活曲線在開時3h后呈增長趨勢，并在27h達到最大活性，隨后，隨培養(yǎng)時間延長，酶的活力開始降低。菌株11的酶活曲線與生長曲線基本吻合，即菌株11生長和產(chǎn)酶基本一致。實驗結果---碳源種類對菌株產(chǎn)酶影響由圖可以看出,分別以相同濃度的瓊膠、卡拉膠、海藻酸鈉和淀粉作為發(fā)酵培養(yǎng)的唯一碳源時，菌株11在以海藻酸鈉為唯一碳源時

7、產(chǎn)酶活力高于其他，表明菌株11所產(chǎn)的海藻膠酶為誘導酶。實驗結果---碳源濃度對菌株產(chǎn)酶影響由圖可以看出，在培養(yǎng)基中海藻酸鈉濃度為0.7％時，菌株11的產(chǎn)酶活力最高，因此選擇海藻酸鈉濃度為0.7％的培養(yǎng)基為最適培養(yǎng)基。實驗結果--氯化鈉濃度對菌株產(chǎn)酶影響由圖可以看出，在培養(yǎng)基中氯化鈉濃度為2.5％時，菌株11的產(chǎn)酶活力較高于其他濃度，因此選擇氯化鈉濃度為2.5％的培養(yǎng)基為最適培養(yǎng)基。實驗結果---pH對菌株產(chǎn)酶影響由圖可以看出，在培養(yǎng)基中的pH為7.2時，菌株11的產(chǎn)酶活力明顯高于其他pH，因此選擇pH7.2為最適pH。實驗結

8、果--蛋白胨濃度對菌株產(chǎn)酶影響由圖可以看出，在培養(yǎng)基中蛋白胨濃度為0.3％時，菌株11的產(chǎn)酶活力最高，因此選擇蛋白胨濃度0.3％的培養(yǎng)基為最適培養(yǎng)基。討論分析1.從腐爛的海帶上篩選出得到10多株能夠產(chǎn)海藻膠裂解酶的細菌，通過比較菌落周圍透明圈與菌落的直徑比值以及透明圈的透明度，選擇菌株11