鴨疫里默氏桿菌pcr快速檢測(cè)方法的建立

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1、弘笛科字UU．1l鴨疫里默氏桿菌PCR，I央速檢測(cè)方法的建立郭遠(yuǎn)奎(榮成市崖頭畜牧獸醫(yī)站，山東264300)摘要：在鴨疫里默氏桿菌外膜蛋白保守區(qū)設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，建立PCR方法，對(duì)5株已知血清型的鴨疫里默氏桿菌純培養(yǎng)菌和6株，臨床分離未定型的里默氏桿菌菌株以及病死鴨病料組織進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明不同樣品都可擴(kuò)增出592bp的特異目的條帶，而對(duì)鴨源大腸桿菌、鴨源多殺性巴氏桿菌、鴨源沙門氏菌的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性，說明該P(yáng)CR法具有較好的特異性，可用于快速鑒定鴨疫里默氏桿菌，也適用于病料的直接檢測(cè)。關(guān)鍵詞：鴨疫里氏桿菌；聚合酶

2、鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；檢測(cè)中圖分類號(hào)：S858．32文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B文章編號(hào)：l673—1085(2O09)ll一00O6—03鴨疫里默氏桿菌病即鴨漿膜炎．是由鴨疫里默1．1材料氏桿菌(Riemerellaanatipestifer，RA)引起鴨的一種1．1．1供試菌株已知血清型鴨疫里默氏桿菌5急性或慢性傳染病，發(fā)病率為10％～90％，病死率高株和鴨源大腸桿菌、沙門氏菌、巴氏桿菌各兩株由達(dá)80％[1l。給養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所提供，其他6株未定RA已成為危害我國(guó)養(yǎng)鴨業(yè)的主要細(xì)菌性傳染病之型鴨疫里默

3、氏桿菌菌株從發(fā)病鴨場(chǎng)分離并鑒定。一吲。臨床上鴨疫里默氏桿菌常與大腸桿菌、巴氏桿1．1．2主要試劑和培養(yǎng)基細(xì)菌基因組DNA提取菌及沙門氏菌混合感染．由于其臨床癥狀和病理變?cè)噭┖袨榘偬┛斯井a(chǎn)品，Taq酶及其緩沖液、化與上述細(xì)菌病很相似，難以鑒別進(jìn)而不能有效防dNTP、DNAMarkerDl200O購(gòu)自寶生物工程(大連)治。需建立快速診斷方法來區(qū)分?，F(xiàn)在的鴨場(chǎng)在發(fā)有限公司，TSA(Tryptics0yAgar)為青島海博公司現(xiàn)鴨群有病時(shí)，立即用藥，這樣的鴨場(chǎng)送檢的病料常產(chǎn)品。分離不到細(xì)菌，為了進(jìn)行RA的流行病學(xué)研究必須1．

4、2PCR擴(kuò)增建立鑒定RA的分子方法本研究為解決以上問題ll2．1PcR引物根據(jù)已發(fā)表RA的外膜蛋白A建立了鴨疫里默氏桿菌的PcR檢測(cè)方法(0mpA)基因序列，在其高度保守區(qū)設(shè)計(jì)了一對(duì)特異1材料與方法性弓I物：P1：5一GGAGCCAACTATICAGAC一3．收稿日期：2009一l0一l6P2：5一GACCTGGAACATrAGGACACT一3，擴(kuò)增現(xiàn)階段所分離鑒定出的H、H]、H、H、H及H等流感具有重要的公共衛(wèi)生意義。AIV的生物學(xué)和遺多種亞型的禽流感病毒株也提示，誰也無法預(yù)料我傳學(xué)特性決定了研究要不斷面臨新的挑戰(zhàn)

5、，使得對(duì)們將面對(duì)何種生物學(xué)特點(diǎn)和致病力的禽流感病毒，禽流感的研究和控制己刻不容緩。必須用科學(xué)的方我們注定要不斷面臨新的挑戰(zhàn)法來控制禽流感的流行。因此．新的更有效的疫苗由于禽流感是一種全球性的烈性傳染病，可在研究勢(shì)在必行?！案呖萍肌钡那萘鞲幸呙绫仨毤浪拗髦袛喟l(fā)乍變異和基因重組，因此將是2l世病、防病毒隱藏、防病毒擴(kuò)散于一身。理想的禽流感紀(jì)我養(yǎng)ll，I?最大的瘟疫性威脅禽流感可在疫苗必須同時(shí)具備誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體和CTL反禽、豬和人r{，進(jìn)f傳播AIV不僅作為人流感的應(yīng)。隨著科技的進(jìn)步和人們對(duì)生命的認(rèn)識(shí)不斷加最大璉4?J接

6、域人類健康，而且可作為人類深，有理由相信一種能改變流感病毒防治狀況的新的靳t{j=?l¨受緗塒人類的威脅。因此．預(yù)防禽型疫苗的出現(xiàn)指日可待?？?，0，vcene片段長(zhǎng)度為592bp，由北京博尚生物工程有限公司合成。1．2．2模板DNA的制備1．2．2．1基因組DNA模板的制備挑取TSA平板上單個(gè)菌落，接種于rrSA液體培養(yǎng)基，37℃快速搖振培養(yǎng)20h，離心取菌泥，用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取各菌株的基因組DNA，作為PcR的模板。圖l以基因組DNA為模板RA菌株的PCR擴(kuò)增結(jié)果1．2．2．2病料中PCR模板的制備取

7、病死鴨的各種注：1—5為已知血清型的RA，6一ll為未知血清型組織約1mms，勻漿器研磨均勻．于加有5％的小牛血的RA，M為DNAMarker20o0。清和5Og，ml的慶大霉素的TsA液體培養(yǎng)基中增殖照菌未出現(xiàn)相應(yīng)條帶。見圖2。4h后，吸取懸濁液于離心管用生理鹽水洗滌1次．再按煮沸法提取模板DNA，用于PcR擴(kuò)增。1．3PCR檢測(cè)體系的建立以細(xì)菌的基因組DNA和病料提取液為模板，利用設(shè)計(jì)好的引物，進(jìn)行PcR2O08IOOOO擴(kuò)增。反應(yīng)體系(501)：1Oxbuffer5l，2．5mmol，25OlOOlMgCl23肛

8、l，2．5mmol／ldNTP4l，20pmol／mlPI1l，20pmoP21l，DNATemplate1l，TaqDNAPoly—mer—ase0．5l，ddH2O34．5l。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋簣D2PCR方法的特異性檢測(cè)結(jié)果注：1～5為已知血清型的RA，6、7為鴨源大腸94℃5min；進(jìn)入PCR循環(huán)94cC30s，54．3℃6