阿特拉津高效降解菌及其降解酶粗酶液特性的研究

阿特拉津高效降解菌及其降解酶粗酶液特性的研究

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1、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文阿特拉津高效降解菌及其降解酶粗酶液特性的研究姓名:應(yīng)飛申請學(xué)位級別:碩士專業(yè):農(nóng)業(yè)昆蟲與害蟲防治指導(dǎo)教師:謝明20070601摘要阿特拉津是均三氮笨類內(nèi)吸傳導(dǎo)型除草幫,J’泛用于玉米、高粱、甘蔗、果園等防除一年生禾本科雜草及闊葉雜草,在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有重要作用。阿特拉津在全世界火面積推廣應(yīng)用后,其對農(nóng)珥及地下水酶污染、對壓茬作耪的藥襄、對人類潛在的遺傳毒性笛融題日益突出。為了利用安全高教的生物降解技術(shù)控制和消除阿特拉洋在農(nóng)田環(huán)境中的殘留污染,本研究分離、篩選對阿特拉津具有贏效降解能力的菌株,研究了降解菌及其降解酶特性,為開發(fā)和應(yīng)用酶制劑提供基礎(chǔ)。本研究結(jié)果對控

2、制農(nóng)田污染,促進(jìn)糧食安全生產(chǎn),保障人類身體健康,僳護(hù)生態(tài)環(huán)境均其有重要意義。具體研究結(jié)果如F:應(yīng)用搖瓶釀l化珞莽方法,從潷北、山農(nóng)等墻農(nóng)藥廠捧污[::l淤泥中分離得到4株對§玎特拉津有降解能力的細(xì)菌;比較菌株對阿特拉津的降解效率,從中篩選fⅡ1株高效降解新菌株BZB一1。運(yùn)用形態(tài)與生理生純特征獲發(fā)16SrDNA穿列分析等方法對菌株BZB一1送行鑒定。其形態(tài)及生理生化特征:革蘭氏陰性菌,細(xì)胞呈長桿狀,無芽孢,極生鞭毛,具有運(yùn)動(dòng)性,氧化酶陽性,接觸酶雕性。該菌株為好氧、氧化型(菲發(fā)酵型)細(xì)港,能利用葡萄糖和乙醇,不能利用甲醇和乳酸,可以利用氨態(tài)氮和硝態(tài)氮優(yōu)合物,NaCl的耐受濃度為0.5

3、~2%,生長漏度耐受范圍為4q5℃。精氨酸脫羧酶陰性,晦氫酸脫羧酶陰性,賴氨酸脫羧酶陰性,枸櫞酸鹽陰性,硝酸鹽還原陰性,尿酶陽性,七葉靈(蓊)水解酶羯性,蛋彝胨水(靛基質(zhì)試驗(yàn))陰性,o一硝基萃一B—D鴦E曛半乳糖苷酶(ONPG)陰性,蔗糖水解酶陽性,麥芽糖水解酶陽性,木糖水解酶陽性,葡萄糖水解酶

4、;日性,硫化氫陰性。BZB.1菌株的16SrDNA基閑序列與Shinellagranuli(顆粒申氏桿菌)的同源性達(dá)到99%,結(jié)合菌株的形態(tài)和生理生億特性,綜合判定該菌株為Shinellagranuli,此屬種類在我國未見報(bào)道。研究明確了顆粒申氏桿菌ShinellagranuliBZB.1菌

5、株生長的基本規(guī)律和基本條件。顙粒申氏桿菌ShinellagranuliBZB.1菌株在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上生長時(shí),o一6h處于延遲生躍期,6*20h對處于對數(shù)生長期,2011阻罱進(jìn)入穩(wěn)定及衰亡期;菌株BZB.1對溫度的透癍范圍較廣,在4-~454C的條件下均能生長,最適生長溫度為30Z:;菌株適宜的pH儆為6~9之間,最適pH為7;菌株生長對氧的需求量不贏,菌體有高濃度發(fā)酵生產(chǎn)的潛力。通過研究還明確了環(huán)境醫(yī)予對BZB一1蘑株降解效率的影響。葙用氣相色譜監(jiān)測底物(阿特拉溶)變化量,5町特拉津底物濃度對降解率有顯著影響,當(dāng)阿特拉津濃度較低時(shí)(200mg/L),菌株BZB一1在3天內(nèi)即可將

6、其完全晦解(未檢出,撿測聚為0.01ng/p1),隧§玎轉(zhuǎn)拉津濃度升高,其完全降解的時(shí)間也相應(yīng)明顯延長。接菌量對降解效率有顯著影響,隨著培養(yǎng)基中接種的菌體濃度的提高,阿特拉津的降解率也逐漸增加,在無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中,當(dāng)接菌濃度從2.56×106c/h/ml增赫到3.28×108cfulml時(shí),其稆應(yīng)的降解率從54.o%提高到99.7%。pH德對降解率有顯著影嚷,當(dāng)pH值為6—7時(shí),菌株的降解效率較高(96.1—100%),pH值大于7時(shí)或pH值小于6時(shí),降解率明強(qiáng)降低(pH值為8對,降搬效率為54.O%;prt值為5丑寸,降解率為79.7%),降解最適pH為7。溫度對降解率的影響明嶷

7、,瀚株降解的最適溫度為20—35。C,其降解率均大于98.3%,當(dāng)溫度小于20℃(88.8%)或高于35℃時(shí)(89.1%).菌株的f鋒解力瑪開媲明顯下降。為了明確菌株降解酶的利用價(jià)值,本文研究了降解酶粗酶液的基本特性。通過酶定位實(shí)驗(yàn),明確了該菌株豹§時(shí)特拉津降解酶位子緩胞內(nèi),粗酶渡與阿特拉津(底物濃發(fā)50mgm,pH7。0,磷酸緩沖液體系3ml,溫度30*(2)作用2h,其對底物的去除率可達(dá)到99.0%。結(jié)果表明,菌株BZB.1分泌的降解酶為組成型酶,在無底物誘導(dǎo)的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基}:連續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)8代后,該菌對阿特拉津的降解能力仍保持在較高水平,底物誘導(dǎo)前后該菌對阿特拉律的降解能力

8、無顯著變化。溫度對粗酶液降解活性的影響明鼴,降解酶適宜的溫度為25—35℃,35℃時(shí)粗酶液對阿特拉津的降解率為73.5%(酶與底物作用O,5h),離漱會使酶瓣酶解活性驟然下降(40。C酶對底物的降解率為34.5%)。pH對粗酶液降解活性的影響明疆,當(dāng)pH值為5~9.2,酶的活性隨pH值的升高而上升,pH值為9.2時(shí)酶的活性最高(69.6%,酶與底物作用時(shí)間0.5h)。由此看來,該菌株產(chǎn)酶穩(wěn)定(組成摯酶),降解酶對溢度、pt-I的適應(yīng)范羽較j、‘,對底物的降

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