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1、安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文雞IL-2和NDV-F基因的克隆、表達(dá)及其融合基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建姓名：許發(fā)芝申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師：余為一20040601摘要新城疫(NewcastleDisease，ND)是由新城疫病毒(Newcastlediseasevinls，NDV)引起的一種具有高度傳染性的病毒性傳染病。NDV能感染雞、火雞、鴨、鴿子和野生鸚鵡等多種禽類。由于ND給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，被國(guó)際獸疫局定為A類傳染病。研究證明，在NDV感染過(guò)程中，位于病毒囊膜上的融合蛋白(F蛋白)是病毒穿入細(xì)胞，使宿主細(xì)胞產(chǎn)生融合和溶血的重要因子；同時(shí)也是病毒的主要保護(hù)性抗原。
2、正因?yàn)槿绱?，F(xiàn)蛋白已經(jīng)成為研究新城疫基因工程疫苗和DNA疫苗等新型疫苗的首選抗原。白細(xì)胞介素2(Imerleukin．2，IL．2)是由T細(xì)胞分泌的一種重要淋巴因子，它具有促進(jìn)T細(xì)胞、B細(xì)胞的增殖和分化，增強(qiáng)單核細(xì)胞以及NK細(xì)胞的殺傷活性等免疫調(diào)節(jié)功能。IL．2的這種免疫調(diào)節(jié)功能，還表現(xiàn)在能夠增強(qiáng)疫苗誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)。因此，近年來(lái)IL．2常被用來(lái)作為DNA疫苗的免疫佐劑，成為免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)。為了深入研究新城疫DNA疫苗，提高DNA疫苗的免疫應(yīng)答效果，本研究運(yùn)用分子克隆技術(shù)，分別獲得了NDV的F基因和雞的IL一2基因，并在真核細(xì)胞和原核細(xì)胞中進(jìn)行了表達(dá)。首先。根據(jù)GenBank中登
3、錄的F48E9株F基因序列和雞IL．2基因序列以及真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3的多克隆位點(diǎn)，自行設(shè)計(jì)了兩對(duì)F基因序列引物，’之們是PFA：5’一CCCAAGCTT-ATGGGCCCCAAATCTTClACC．3’，PFBS：5’一CGGGArCC．TCAGATTCTTGTAGTGGCCCTC一3’，PFBF：5’一CGGGATCC．GA訂CTTGTAGTGGCCCTC．3’；兩對(duì)雞IL．2基因序列引物：它們是P璩s：5’．CGGGATCC—CTGCcATGATGTGCAAAGTAC一3’，PIAF：5’CGGGAreC!GG稻玨eGGACTGCCATGATGTGCAAAG．3’，PI
4、B：5’GCTC，fAGA．CnIATTTTTGCAGA：rATCTCAC．3’。為了便于基因的克隆和表達(dá)，我們?cè)谝锏?’端設(shè)計(jì)了相應(yīng)的酶切位點(diǎn)、保護(hù)位點(diǎn)、連接臂、起始密碼和終止密碼。應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT_PcR)技術(shù)，從接種NDVF48E9株的雞胚尿囊液中擴(kuò)增獲得了大小約為1660bp的基因片段：從conA誘導(dǎo)培養(yǎng)8h的雞脾淋巴細(xì)胞中擴(kuò)增獲得了大小約為440b口的基因片段，分別與GenBalll(中登錄的NDVF基因和雞IL．2基因大小一致。經(jīng)單酶切鑒定，這兩個(gè)片段中均存在與NDVF基因和雞IL．2基因相同的酶切位點(diǎn)。將其分別連接到pcDNA3質(zhì)粒上，經(jīng)質(zhì)粒PcR和雙
5、酶切鑒定后，篩選獲得陽(yáng)性重組克隆pcDNA3．IL．2和pcDNA3．F。核苷酸序列測(cè)定分析表明，NDvF基因開放閱讀框由1662個(gè)核苷酸組成，編碼553個(gè)氨基酸，與已報(bào)道NDvF基因的同源性為99％；雞IL．2基因開放閱讀框由432個(gè)核苷酸組成，編碼143個(gè)氨基酸，與已報(bào)道雞IL一2基因的同源性為98％。這表明本實(shí)驗(yàn)已成功地克隆了NDvF基因和雞IL．2基因。再通過(guò)連接臂將F基因和IL．2基因進(jìn)行連接，插入到口cDNA3質(zhì)粒的HindIII和xbaI多克隆位點(diǎn)之間，經(jīng)質(zhì)粒PCR、雙酶切和序列測(cè)定進(jìn)行了鑒定，結(jié)果表明，已成功地構(gòu)建了融合基因的重組質(zhì)粒，并將其命名為∞D(zhuǎn)NA3．F．
6、IL．2重組質(zhì)粒。其次，為了檢測(cè)NDvF基因疫苗的體外表達(dá)效果，我們將pcDNA3．F重組表達(dá)質(zhì)粒和pcDNA3空質(zhì)粒經(jīng)由脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法分別轉(zhuǎn)染到COs．7細(xì)胞和p815細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)免疫熒光染色法、RT-PcR法和wbstcmbiotcing法檢測(cè)目的基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)染的p815細(xì)胞用G418經(jīng)2～3周的克隆篩選，獲得了具有G418抗性并能夠穩(wěn)定表達(dá)F基因的p815．F細(xì)胞株。免疫熒光染色的結(jié)果顯示，F(xiàn)基因在轉(zhuǎn)染的COS．7細(xì)胞和p815細(xì)胞株中，分別獲得了～過(guò)性表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)。RT．PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)基因被成功地整合到P815細(xì)胞株的染色體中并能正確地轉(zhuǎn)錄出其mRNA。wi
7、stemblo佳ing結(jié)果則表明，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的p815細(xì)胞裂解物在分子量約為60000的位置出現(xiàn)一條特異性的染色條帶，而轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的p815細(xì)胞裂解物則沒有任何條帶出現(xiàn)。最后，應(yīng)用DNA重組技術(shù)，將雞IL．2基因亞克隆到原核表達(dá)質(zhì)粒pGEx．4T．1中，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL2l菌株。經(jīng)IPTG37℃誘導(dǎo)表達(dá)4h后，sDs．PAGE電泳結(jié)果顯示，谷胱苷肽．s．轉(zhuǎn)移酶(GsT)與雞IL．2的融合蛋白得到了表達(dá)，分子量約為42000，主要以包涵體形式存在。表達(dá)產(chǎn)物在十二烷基肌氨酸鈉存在
