實驗多抗制備4免疫比濁

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1、沉淀反應(yīng)微生物與免疫教研室本次實驗內(nèi)容實驗一、雙向免疫擴散試驗——LDL多抗鑒定及效價測定實驗二、免疫濁度測定——免疫球蛋白檢測一、本次實驗的目的：1、掌握可溶性抗原制備抗血清鑒定的常用方法。2、掌握雙向免疫擴散試驗方法。3、掌握抗體效價的判斷。4、掌握免疫濁度的測定原理。5、熟悉免疫球蛋白檢測的臨床意義。沉淀反應(yīng)（precipitation）可溶性抗原與相應(yīng)抗體在適當(dāng)條件下發(fā)生特異性結(jié)合所出現(xiàn)的沉淀現(xiàn)象。分類液體內(nèi)沉淀試驗絮狀沉淀試驗環(huán)狀沉淀試驗免疫濁度測定凝膠內(nèi)沉淀試驗免疫擴散免疫電泳單向免疫擴散試驗雙向免疫擴

2、散試驗火箭免疫電泳對流免疫電泳沉淀反應(yīng)思考：抗原抗體反應(yīng)的四大特點？特異性可逆性比例性階段性沉淀反應(yīng)的特點抗原為可溶性物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、多糖沉淀反應(yīng)分兩個階段：第一階段、抗原抗體特異性結(jié)合(不可見)第二階段、形成可見的免疫復(fù)合物（可見）條件電解質(zhì)，溫度，酸堿度凝膠內(nèi)沉淀試驗(gelphaseprecipitation)主要是指瓊脂糖擴散或稱凝膠擴散(geldiffusion)。常用的凝膠有瓊脂、瓊脂糖、葡聚糖或聚丙稀酰胺凝膠等?！锔鶕?jù)實驗?zāi)康呐c方法不同，可將固相內(nèi)沉淀驗分為2類：（一）免疫擴散①單向免疫擴散試驗(si

3、nglegeldiffusiontest)②雙向免疫擴散試驗(doublegeldiffusiontest)（二）凝膠免疫電泳(gelimmuno-electrophoresis)火箭免疫電泳雙擴散免疫電泳一、單向免疫擴散試驗(一)原理將一定量的抗體混入瓊脂凝膠中，使待測的抗原物質(zhì)在凝膠中自由擴散，與抗體結(jié)合形成沉淀環(huán)，沉淀環(huán)的大小與抗原濃度呈正相關(guān)。(二)操作步驟（平板法）1.將抗體和0.9%瓊脂糖50-56℃混合,即刻傾注成平板。2.待凝固后在瓊脂板上打孔,孔中加入已稀釋的抗原溶液和不同濃度的抗原標(biāo)準(zhǔn)品溶液。3

4、.置37℃,讓其向四周自由擴散,24-48h后可見其孔周圍出現(xiàn)沉淀環(huán)。單向輻射狀免疫擴散上排為5個不同的參考，中、下排為患者血清，下排右2為一異常病理血清(三)方法評價單向瓊脂擴散試驗是一種穩(wěn)定、簡便、毋需特殊設(shè)備，一般實驗室均可使用的常規(guī)方法，試驗的重復(fù)性和線性均好。敏感度為1.25mg/L(四)影響因素1.抗原分子量抗原分子量大，擴散慢，沉淀環(huán)較小；抗原分子量小，擴散快，沉淀環(huán)相對較大。要求待檢血清和抗原標(biāo)準(zhǔn)品在血清學(xué)上具有均一性，否則可能出現(xiàn)結(jié)果偏高或偏低。2.抗體種類實驗證明兔抗血清優(yōu)于馬、羊抗血清，兔抗血

5、清可測抗原0.1~1IU/ml，馬抗血清為1~10IU/ml，羊為0.4~4IU/ml，為提高實驗敏感度，應(yīng)首選敏感度高的抗血清。3.抗體稀釋度抗體濃度大，沉淀環(huán)小，則敏感度低；抗體濃度小，沉淀環(huán)增大，不同濃度抗原間的差別較顯著，敏感度高。但沉淀環(huán)過大，常造成邊緣糊不清，致使測量誤差也增大。因此要求在沉淀環(huán)清晰的基礎(chǔ)上加大稀釋度以提高敏感度。二、雙向瓊脂擴散試驗(一)原理將可溶性抗原和抗體置于瓊脂凝膠板的對應(yīng)孔中，兩者各自在凝膠中向四周自由擴散，當(dāng)抗原與抗體相遇，在比例合適時形成可見的白色沉淀線。沉淀線的特征與抗原

6、抗體的濃度、純度和擴散速率等有關(guān)。(二)操作步驟（平板法）融化瓊脂，澆板每張載玻片約4ml。凝固，打孔孔徑3mm，孔間距3~5mm，孔型有雙孔型、三角孔型、雙排孔型和梅花孔型。加樣在相對孔內(nèi)加抗原或抗體。孵育使抗原抗體自由擴散，在兩孔之間抗原抗體相遇，在比例適時形成可見的沉淀線。沉淀線的數(shù)目、形態(tài)和位置與抗原和抗體的純度、濃度和擴散速度有關(guān)。(三)雙向免疫擴散試驗的應(yīng)用1.檢測未知抗原或抗體及其相對含量將已知的抗體或抗原與待檢標(biāo)本加入成對孔中根據(jù)沉淀線有無定性；根據(jù)沉淀線的位置估計抗原或抗體的相對含量根據(jù)沉淀弧形狀

7、判斷抗原或抗體的相對擴散速率。沉淀線形狀、位置與抗原抗體擴散率及濃度的關(guān)系A(chǔ)：Ag、Ab濃度及擴散率近似；B：Ag、Ab濃度近似，擴散率Ag＞Ab；C：Ag、Ab濃度近似，擴散率Ag＜Ab；D：擴散率近似，濃度Ag＞Ab；E：濃度Ag＞Ab，擴散率Ag＞Ab；F：濃度Ag＜Ab，擴散率Ag＜Ab2.抗原性質(zhì)分析利用三角孔型，將待檢抗原和標(biāo)準(zhǔn)抗原加入相鄰兩個孔中，與另一孔相對，根據(jù)沉淀線形狀分析待測抗原，見圖。三種擴散基本圖型3.抗體效價滴定用梅花型孔，中間放抗原，周圍孔放下不同稀釋度的相應(yīng)抗體，以出現(xiàn)沉淀線的最高稀

8、釋倍數(shù)為該抗體的效價。效價檢測結(jié)果該圖是經(jīng)過一次基礎(chǔ)免疫，三次加強免疫，間隔七天之后，頸動脈取血所得血清測定的效價。免疫雙擴散測效價，加樣方式同上，從圖中可以看出最后測得的效價分別為：1：256，1：128，1：128中間孔—抗原；周圍孔——血清血清的稀釋倍數(shù)分別為：孔1—1/8；孔2—1/16；孔3—1/32；孔4—1/64；孔5—1/128；孔6—1/2