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《耐熱木聚糖酶雜合基因的構(gòu)建、表達(dá)及產(chǎn)物的酶學(xué)特性研究》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、浙江大學(xué)博士學(xué)位論文耐熱木聚糖酶雜合基因的構(gòu)建、表達(dá)及產(chǎn)物的酶學(xué)特性研究姓名：孫建義申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：特種經(jīng)濟(jì)動物與飼養(yǎng)指導(dǎo)教師：許梓榮20030501耐熱末聚耱酶雜臺基因的構(gòu)建、表達(dá)噩產(chǎn)物的酶學(xué)特性研究博士學(xué)位論文在pH5．0～7．0之間酶活性較高，pH4．0～7．0之間較為穩(wěn)定；Tfx的最適反應(yīng)pH為6．0，在pH5．0～7．0之間酶活性較高，pH5．0～9．0之間較為穩(wěn)定。通過對木聚糖酶BSX和Tfx的成熟肽氨基酸序列同源性和二級結(jié)構(gòu)單元的分析，設(shè)計(jì)并構(gòu)建了耐熱雜合木聚糖酶分子，通過表達(dá)獲得了耐熱雜合木聚糖酶基因工程菌EcoliHX，分
2、離和純化了表達(dá)產(chǎn)物，進(jìn)而系統(tǒng)研究了其酶學(xué)特性。以pGEM*．TEasyBSXVector為模板，5RBsX02、3RBsX01(含限制性內(nèi)切酶XhoI)為引物擴(kuò)增出532bp基因片斷；以pGEM。一TEasyTfxVector為模板，5RBsX01(含限制性內(nèi)切酶BamHI)、3RBsX02為引物擴(kuò)增出117bp基因片斷；以這兩個基因片段為模板，5RBsX0l、3RBsX01為引物，采用基因拼接技術(shù)(SOE)構(gòu)建了長度為628bp的木聚糖酶雜合基因，獲得了含雜合基因的重組質(zhì)粒pGEM。-TEasyHXVector。將經(jīng)BamHI和XhoI雙酶切獲得
3、的雜合基因連接到經(jīng)相同酶切的pET30a(+)表達(dá)載體中，并導(dǎo)入到EcoliBL21中表達(dá)。采用RBB．木聚糖水解透明圈技術(shù)，獲得了基因工程菌E．coliHX菌株。在LB培養(yǎng)基中37℃下培養(yǎng)16h，該基因工程菌單位發(fā)酵液酶活性為288U／ml；與出發(fā)菌株的枯草芽孢桿菌2和褐色高溫單孢菌TF及其基因工程菌E．coliBSX和EcoliTfx相比，酶活分別提高了3．77倍、6．50倍、27．29倍和9．42倍。酶學(xué)特性研究表明．雜合木聚糖酶HX分子量為27．2kDa，最適反應(yīng)溫度為50～60℃；模擬飼料制粒溫度，經(jīng)70℃、80℃和90℃處理2min，H
4、X存活率分別為96％、74％和48％，而親本木聚糖酶BSX和Tfx存活率分別為17％、9％、2％和78％、40％、12％，與BSX和Tfx相比，HX分別提高了4。65倍、7。22倍、23．00倍和O。23倍、0．85倍、3．OO倍。雜合木聚糖酶HX最適反應(yīng)pH為6．O～7．0；最穩(wěn)定pH為5．O～7．0。在37"C、pH6．0(模擬動物小腸生理環(huán)境)條件下，相同酶活的HX在RBB．木聚糖平板上的水解透明圈顯著大于木聚糖酶Tfx和BSX：在pH6．0、40℃保溫40min，HX使木聚糖粘度下降15．15％，而BSX和Tfx分別下降9．09％和0％。關(guān)
5、鍵詞微生物：RBB．木聚糖：木聚糖酶：基因克?。弘s合木聚糖酶基因構(gòu)建：表達(dá)；熱穩(wěn)定性耐熱術(shù)聚糖酶雜合基因的構(gòu)建、表達(dá)及產(chǎn)物的酶學(xué)特性研究博士學(xué)位論文AbstractThethermostabilityofxylmrlase(E．C．3．2．1．8)iscriticaltoitsactivity．Thefeedreachestemperaturesbetween70～80℃duringthepelletingprocessbystemadditionintheconditioneLandtheprocesscall，therefore，leadtol
6、ossesinactivityofaddedxylanase．Itbecomesaveryimportantissuet0increasethethermostabilityofxylanase．111epurposeofthisstudywastoscr∞nthewildstrainsofxylanaseproducingmicrobes，toclonexylanasegenesoreDNA，toexpressthesegenesintheEcoliusingpET30(a’卜卜asexpressionvector,toassesstheprop
7、ertiesofdifferentlyexpressedxylanases．Furthermore，thehybridxylanasegeneH)('whichcallexpressthermostablexytanase，wasdesignedandconstructedusingSplicingbyOverlapExtension(SOE)technique，andexpressedinEcoli．Thebiochemicalpropertiesofpurifiedhybridxylanase，particularlyintheenhanced
8、stabilityathighertemperatureascomparedtothoseoftheparents，wer
