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《耐熱木聚糖酶雜合基因的構(gòu)建、表達(dá)及產(chǎn)物的酶學(xué)特性研究》由會員上傳分享,免費(fèi)在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、浙江大學(xué)博士學(xué)位論文耐熱木聚糖酶雜合基因的構(gòu)建、表達(dá)及產(chǎn)物的酶學(xué)特性研究姓名:孫建義申請學(xué)位級別:博士專業(yè):特種經(jīng)濟(jì)動物與飼養(yǎng)指導(dǎo)教師:許梓榮20030501耐熱末聚耱酶雜臺基因的構(gòu)建、表達(dá)噩產(chǎn)物的酶學(xué)特性研究博士學(xué)位論文在pH5.0~7.0之間酶活性較高,pH4.0~7.0之間較為穩(wěn)定;Tfx的最適反應(yīng)pH為6.0,在pH5.0~7.0之間酶活性較高,pH5.0~9.0之間較為穩(wěn)定。通過對木聚糖酶BSX和Tfx的成熟肽氨基酸序列同源性和二級結(jié)構(gòu)單元的分析,設(shè)計(jì)并構(gòu)建了耐熱雜合木聚糖酶分子,通過表達(dá)獲得了耐熱雜合木聚糖酶基因工程菌EcoliHX,分
2、離和純化了表達(dá)產(chǎn)物,進(jìn)而系統(tǒng)研究了其酶學(xué)特性。以pGEM*.TEasyBSXVector為模板,5RBsX02、3RBsX01(含限制性內(nèi)切酶XhoI)為引物擴(kuò)增出532bp基因片斷;以pGEM。一TEasyTfxVector為模板,5RBsX01(含限制性內(nèi)切酶BamHI)、3RBsX02為引物擴(kuò)增出117bp基因片斷;以這兩個基因片段為模板,5RBsX0l、3RBsX01為引物,采用基因拼接技術(shù)(SOE)構(gòu)建了長度為628bp的木聚糖酶雜合基因,獲得了含雜合基因的重組質(zhì)粒pGEM。-TEasyHXVector。將經(jīng)BamHI和XhoI雙酶切獲得
3、的雜合基因連接到經(jīng)相同酶切的pET30a(+)表達(dá)載體中,并導(dǎo)入到EcoliBL21中表達(dá)。采用RBB.木聚糖水解透明圈技術(shù),獲得了基因工程菌E.coliHX菌株。在LB培養(yǎng)基中37℃下培養(yǎng)16h,該基因工程菌單位發(fā)酵液酶活性為288U/ml;與出發(fā)菌株的枯草芽孢桿菌2和褐色高溫單孢菌TF及其基因工程菌E.coliBSX和EcoliTfx相比,酶活分別提高了3.77倍、6.50倍、27.29倍和9.42倍。酶學(xué)特性研究表明.雜合木聚糖酶HX分子量為27.2kDa,最適反應(yīng)溫度為50~60℃;模擬飼料制粒溫度,經(jīng)70℃、80℃和90℃處理2min,H
4、X存活率分別為96%、74%和48%,而親本木聚糖酶BSX和Tfx存活率分別為17%、9%、2%和78%、40%、12%,與BSX和Tfx相比,HX分別提高了4。65倍、7。22倍、23.00倍和O。23倍、0.85倍、3.OO倍。雜合木聚糖酶HX最適反應(yīng)pH為6.O~7.0;最穩(wěn)定pH為5.O~7.0。在37"C、pH6.0(模擬動物小腸生理環(huán)境)條件下,相同酶活的HX在RBB.木聚糖平板上的水解透明圈顯著大于木聚糖酶Tfx和BSX:在pH6.0、40℃保溫40min,HX使木聚糖粘度下降15.15%,而BSX和Tfx分別下降9.09%和0%。關(guān)
5、鍵詞微生物:RBB.木聚糖:木聚糖酶:基因克?。弘s合木聚糖酶基因構(gòu)建:表達(dá);熱穩(wěn)定性耐熱術(shù)聚糖酶雜合基因的構(gòu)建、表達(dá)及產(chǎn)物的酶學(xué)特性研究博士學(xué)位論文AbstractThethermostabilityofxylmrlase(E.C.3.2.1.8)iscriticaltoitsactivity.Thefeedreachestemperaturesbetween70~80℃duringthepelletingprocessbystemadditionintheconditioneLandtheprocesscall,therefore,leadtol
6、ossesinactivityofaddedxylanase.Itbecomesaveryimportantissuet0increasethethermostabilityofxylanase.111epurposeofthisstudywastoscr∞nthewildstrainsofxylanaseproducingmicrobes,toclonexylanasegenesoreDNA,toexpressthesegenesintheEcoliusingpET30(a’卜卜asexpressionvector,toassesstheprop
7、ertiesofdifferentlyexpressedxylanases.Furthermore,thehybridxylanasegeneH)('whichcallexpressthermostablexytanase,wasdesignedandconstructedusingSplicingbyOverlapExtension(SOE)technique,andexpressedinEcoli.Thebiochemicalpropertiesofpurifiedhybridxylanase,particularlyintheenhanced
8、stabilityathighertemperatureascomparedtothoseoftheparents,wer