球蛋白的分離純化與鑒定

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1、血清?-球蛋白的分離、純化及鑒定實(shí)驗(yàn)十一揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院生化教研室傅奕Contents實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求實(shí)驗(yàn)原理操作步驟結(jié)果分析1234www.themegallery.comCompanyLogo血清?-球蛋白的分離、純化及鑒定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求了解分離純化蛋白質(zhì)的基本原理；掌握柱層析技術(shù)。www.themegallery.comCompanyLogo二、實(shí)驗(yàn)原理本實(shí)驗(yàn)為一綜合性大實(shí)驗(yàn)，目的是要從血清中獲得純化的?-球蛋白。血清?-球蛋白的分離、純化及鑒定血清中的蛋白質(zhì)有兩大類：清蛋白和球蛋白（?、?、?）。（一）如何分離得到球蛋白？鹽析：清蛋白在水中的溶解

2、度大于球蛋白，在血清中加入硫酸銨至半飽和時(shí)，球蛋白可被完全沉淀，而絕大部分清蛋白保持溶解狀態(tài)，依此可將球蛋白和清蛋白分離(離心）。得到球蛋白www.themegallery.comCompanyLogo二、實(shí)驗(yàn)原理血清?-球蛋白的分離、純化及鑒定（二）如何去除球蛋白中的無(wú)機(jī)鹽（硫酸銨）？凝膠層析（凝膠過(guò)濾）脫鹽凝膠層析又稱凝膠過(guò)濾，是選用孔隙大小一定的凝膠，將混合液中的小分子和大分子物質(zhì)“篩”開(kāi)來(lái)的一種分離方法。葡聚糖G-25純化的球蛋白www.themegallery.comCompanyLogo二、實(shí)驗(yàn)原理血清?-球蛋白的分離、純化及鑒定（三）如何分

3、離得到純化的?-球蛋白？在乙酸銨溶液（pH6.5）中?、?-球蛋白帶負(fù)電荷而?-球蛋白帶正電荷www.themegallery.comCompanyLogo二、實(shí)驗(yàn)原理血清?-球蛋白的分離、純化及鑒定（三）如何分離得到純化的?-球蛋白？如何將帶有不同性質(zhì)電荷的蛋白質(zhì)分離呢？離子交換層析：利用各蛋白質(zhì)的電荷量及性質(zhì)不同進(jìn)行分離。離子交換是指溶液中的離子和交換劑上的離子進(jìn)行可逆的交換過(guò)程；帶正電荷的交換劑稱為陰離子交換劑；帶負(fù)電荷的交換劑稱陽(yáng)離子交換劑。本實(shí)驗(yàn)采用的DEAE纖維素是一種陰離子交換劑，其分子帶電形式為：纖維素-OC2H4N+H(C2H5)2，溶

4、液中帶負(fù)電荷的離子可與其進(jìn)行交換結(jié)合，帶正電荷的離子則不能，這樣便可達(dá)到分離純化的目的。www.themegallery.comCompanyLogo血清?-球蛋白的分離、純化及鑒定+www.themegallery.comCompanyLogo二、實(shí)驗(yàn)原理血清?-球蛋白的分離、純化及鑒定（三）如何分離得到純化的?-球蛋白？因?、?球蛋白帶負(fù)電荷而與DEAE纖維素進(jìn)行交換結(jié)合。而?-球蛋白帶正電荷而不與DEAE纖維素進(jìn)行交換結(jié)合，直接從層析柱流出。故經(jīng)DEAE纖維素陰離子交換層析流出的第一部分蛋白質(zhì)即為純化的?-球蛋白。純化前后的?-球蛋白可用電泳法進(jìn)行

5、比較鑒定。（四）如何鑒定?-球蛋白及純度？www.themegallery.comCompanyLogo二、實(shí)驗(yàn)原理血清?-球蛋白的分離、純化及鑒定1.鹽析：分離球蛋白與清蛋白。2.凝膠層析：去除球蛋白中的無(wú)機(jī)鹽（脫鹽）。3.離子交換層析：將?-球蛋白與?、?-球蛋白分離。4.電泳：鑒定?-球蛋白及純度。www.themegallery.comCompanyLogo三、操作步驟血清?-球蛋白的分離、純化及鑒定1.鹽析：分離球蛋白與清蛋白取血清0.75ml，緩慢滴入飽和(NH4)2SO4溶液0.75ml，邊加邊搖，混勻后于室溫中放置10分鐘，然后10000

6、rpm離心10分鐘，并小心傾去上清液。沉淀加蒸餾水0.4ml，使之溶解，即為粗提的球蛋白溶液。www.themegallery.comCompanyLogo三、操作步驟血清?-球蛋白的分離、純化及鑒定2.凝膠層析：去除球蛋白中的無(wú)機(jī)鹽（脫鹽）（1）裝柱：（a）固定層析柱，保持垂直。（b）排氣，并檢查是否通暢。柱內(nèi)留下約5ml乙酸銨。（c）灌膠：用滴管沿管壁自頂部加入攪拌均勻的SephadexG-25懸液，打開(kāi)底部出口，凝膠隨柱內(nèi)溶液慢慢流下而均勻沉降，不斷加入SephadexG-25，至凝膠層積集至約15cm高度即可，床面上保持有少許溶液。關(guān)閉出口。避免

7、氣泡、紋路，凝膠面始終低于液面。如凝膠表面不平時(shí)，可用玻棒輕輕攪動(dòng)，讓凝膠自然沉降，使表層平整。www.themegallery.comCompanyLogo三、操作步驟血清?-球蛋白的分離、純化及鑒定（2）上樣與洗脫：凝膠面始終低于液面使柱上緩沖液面剛好下降到凝膠床表面用滴管吸取鹽析球蛋白液，小心緩慢地加到凝膠床表面上然后打開(kāi)下端出口，使樣品進(jìn)入凝膠床，關(guān)閉出口小心加入少量乙酸銨（約1ml）洗層析柱內(nèi)壁上的樣品，打開(kāi)出口，使溶液進(jìn)入凝膠加入適量乙酸銨溶液開(kāi)始洗脫并收集洗脫液，每分鐘收集15滴淡黃色仔細(xì)清洗試管www.themegallery.comCo

8、mpanyLogo三、操作步驟血清?-球蛋白的分離、純化及鑒定（3）洗脫液中蛋白