雞傳染性法氏囊病病毒地方株基因變異分析及防制研究

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1、中國農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文雞傳染性法氏囊病病毒地方株基因變異分析及防制研究姓名：張春杰申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師：趙德明20031201傳染性法氏囊病病毒地方株基因變異分析及防制研究摘要為探究近年來IBD呈現(xiàn)新特點的原因，澄清10年來洛陽地區(qū)IBDV基因是否發(fā)生了變異及變異的程度，以更好地作好本地區(qū)IBD的防制工作，本研究從以下兒個方面進(jìn)行了IBDV的基閎變異分析及防制技術(shù)研究：1、對收集于洛陽地區(qū)1991年和2001年、前后間隔達(dá)10年之久的兩個時期的8份IBD病料進(jìn)行了病毒的分離鑒定、VP2基因的克隆與序列分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)。8個地方流

2、行株雖均屬于IBDV超強毒株，但各個毒株間也有一定的差異。根據(jù)它們的核苷酸手¨氨基酸罰源性商低可明顯分為三群．分別位于系統(tǒng)進(jìn)化樹上超強毒區(qū)的三個小分支上。第一群包括1991年分離的L912、L914和L916三株；第二群包括L913、L017和L018三株：第三群包括2001年分離的L015和L016二株。群內(nèi)各毒株間同源性較高，在98。3％100％之間；群間各毒株的同源性則相對較低，在95*／'o-97．9％之間。其中最低的為L015和L017、L016和L018二對，同源性均只有95％。進(jìn)一步的序列分析表明，8個地方分離株均具有wlBDV所具有的

3、特征。其中，1991年分離的4株在各親水區(qū)和七肽區(qū)的氨基酸和經(jīng)典株及傳統(tǒng)的超強毒株相比均無明顯的變化；而2001年的4個分離株雖仍符合超強毒株的特點，但在相應(yīng)親水區(qū)均有1-2個氮基酸發(fā)生替換，特別是L015和L016株還出現(xiàn)了4個包括10個參考毒株在內(nèi)的其它各毒株均沒有的氨基酸位點變化。2、在以上工作的基礎(chǔ)上，篩選了二株地方代表株分別制各了囊毒和胚毒二價滅活油乳苗，并分別檢測、比較了其免疫效果。結(jié)果表明，所制備的囊毒滅活苗免疫效果顯著優(yōu)于胚毒滅活苗和活疫苗，在接種后的各個時期(除第lo天外)所產(chǎn)生的AGP抗體效價均顯著高于其它二種疫苗免疫雞(P

4、01)，最高AGP效儈可達(dá)4．8t092，至接種后第90天時，仍具有I．81092的AGP抗體效價：胚毒苗免疫效果雖然差于囊毒苗，但明顯優(yōu)于活疫苗，其最高AGP效價可達(dá)31092．當(dāng)話苗免疫組雞血清中已無可測性抗體時，胚苗組仍具有1．0l092的AGP效價。在接種后第60天時分別應(yīng)用iBDV標(biāo)準(zhǔn)毒、地方超強毒L015和L017所進(jìn)行的攻毒試驗中，囊苗免疫組雞均100％地獲得了保護(hù)；胚苗組雞對這三種強毒株的攻擊，也均可獲得80％的保護(hù)，二種由地方毒株所制備的疫苗均未呈現(xiàn)出對不同毒株抵抗性的不同；而活疫苗組在攻毒試驗中，對不同毒株的攻擊保護(hù)率均較低，分別

5、只有53

6、3％、40％和46．7％，呈現(xiàn)出了一定的差異性；在大田試驗中，所制備的地方株囊毒和胚毒滅活油乳螢與其它活苗聯(lián)合應(yīng)用．保護(hù)率分別可達(dá)100％}1198％以上。3、本研究在國內(nèi)首次從新城疫I系病毒接種的雞胚脾細(xì)胞中擴增出了雞IL—18全基因·并進(jìn)行了序列測定。在此基礎(chǔ)上，利用上游引物設(shè)計的HindllI酶切位點和pMDl8-T載體上的Xba1酶切位點，將雞IL．18基因定向克隆至pcDNA3載體的相應(yīng)位點，從而構(gòu)建了雞IL-18基岡真核表達(dá)載體，井首次將其應(yīng)用于IBD的防制中．觀察了其對IBD胚毒滅活鑿的免疫增強效果。結(jié)果表明，同接種IL．18

7、真核表達(dá)質(zhì)粒與IBD滅活苗的試驗雞所產(chǎn)生的中和抗體效價雖然在接種后的前21天內(nèi)與單純疫苗組相比無明顯差異(P>O．05)，但在接種第28天后·二組中和抗體效價均警現(xiàn)了明顯差異(P<0。05)；其T、B淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)也基本上強于單純疫苗組，尤其是T淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)從接種后第21天開始即明顯強予單純痰曲接種組(P<0．0j)：接種后第42天中國敏業(yè)大學(xué)博。l：學(xué)位論文傳染性法氏囊絹病毒地方株綦因變異分析段防制研究時進(jìn)行的攻毒試驗結(jié)果表明．同時接種fL—18表達(dá)質(zhì)粒的試驗組雞獲得93．份的保護(hù)．而單純搜苗接種組的保護(hù)率只有86．7％。足以證明，雞IL

8、—18真核表達(dá)質(zhì)粒在雞體內(nèi)得到了良好表達(dá)．表達(dá)產(chǎn)物不但具有明顯的增強IBD滅活疫苗誘導(dǎo)細(xì)胞免疫的作．1；}j，同時，對于中和抗體水平的提高、B淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的加強也具有一定的作用，從而提高了IBD胚毒滅活油乳苗的免疫效果。關(guān)鍵詞：IBDV，基因變異，地方株多價滅活油乳苗，IL—18，克隆，免疫增強作用IlTheGeneticVariationAnalysisofInfectiousBursaIDiseaseVirnsIsolatesandPreventionoftheDiseaseAbstractInOrdertoascertainthecause

9、ofIBDepidemicchangingandverifywhetherornotIBDVisolates