蛋白質(zhì)的SDSPAGE電泳

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1、蛋白質(zhì)的SDS—PAGE電泳侯國俊周希彬馬麗娜關(guān)欣12電泳原理3電泳中的不正?，F(xiàn)象4目錄發(fā)展歷史，分類樣品處理PAGE膠發(fā)展歷史1967年由Shapiro建立1969年由Weber和Osborn進一步完善目前已成為分子生物學實驗中常用的一項技術(shù)分類根據(jù)緩沖體系和凝膠孔徑的不同：連續(xù)電泳不連續(xù)電泳根據(jù)樣品的處理方式不同：還原SDS電泳非還原SDS電泳帶有烷基化作用的還原SDS電泳目前實驗室常用不連續(xù)的還原SDS垂直電泳根據(jù)電泳形式：圓盤電泳垂直電泳水平電泳平板電泳垂直電泳裝置不連續(xù)電泳用濃縮膠（上層膠）和分離膠（下層膠）兩種不同濃度，不同PH值的凝膠灌制凝膠板，通過電荷效應(yīng)，濃縮效

2、應(yīng)，分子篩效應(yīng)，達到蛋白質(zhì)高分辨率的分離樣品樣品緩沖液應(yīng)包含以下部分：SDS（十二烷基磺酸鈉）β—巰基乙醇（BME）溴酚藍丙三醇pH=6.8Tris-glycineSDS作用：斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)，與蛋白質(zhì)以一定比例結(jié)合，從而使蛋白質(zhì)帶上負電荷并具有相同的質(zhì)合比，在電泳時遷移速率僅與分子量有關(guān)β—巰基乙醇（BME）阻止半胱氨酸氧化并打開二硫鍵SDS-PAGE測定的是蛋白質(zhì)亞基的分子量溴酚藍丙三醇溴酚藍是一種染料，能夠與蛋白質(zhì)結(jié)合顯示蛋白質(zhì)的運動軌跡丙三醇的密度比水大，使樣品沉淀到加樣槽底部PAGE膠丙烯酰胺（Acr）:形成聚合物鏈甲叉雙丙烯酰胺（Bi

3、s）：交聯(lián)劑，形成縱向橋架過硫酸銨（AP）：引發(fā)劑，產(chǎn)生自由基N，N，N?，N?—四甲基乙二（TEMED）：催化過硫酸銨產(chǎn)生自由基，加速聚合%T=totalmonomerconcentrationAcr+BistotalvolumeX100%孔徑平均大小?%acrylamide孔洞大小決定于（1）Acr與Bis的總量（2）Bis的用量：架橋程度分離膠濃縮膠電泳液三大特色：PH不連續(xù)凝膠濃度不連續(xù)緩沖液成分不連續(xù)ATTENTION:不同的PH，氯離子，甘氨酸將會在電泳過程中發(fā)揮重要作用工作原理蛋白質(zhì)進入分離膠之前，先堆積成一條細線，使每個分子起跑點相同，提高解析度分離膠內(nèi)的電泳按分

4、子量大小進行分離檢測考馬斯亮藍染色銀染色考馬斯亮藍R—250紅藍色，每個分子含有兩個SO3H,偏酸性，結(jié)合在蛋白質(zhì)的堿性基團上染色結(jié)果銀染色機制：將蛋白帶上的硝酸銀（銀離子）還原成金屬銀，使銀顆粒沉積在蛋白帶上應(yīng)用蛋白質(zhì)分子量的測定蛋白質(zhì)純度分析蛋白質(zhì)濃度測定蛋白質(zhì)水解的分析免疫沉淀蛋白的鑒定免疫印記第一步蛋白質(zhì)修飾的鑒定分離和濃縮用于產(chǎn)生抗體的抗原分離放射性標記的蛋白電泳過程中的不正常現(xiàn)象1“微笑”現(xiàn)象指示劑前言呈現(xiàn)兩邊向上的曲線形，說明凝膠的不均勻冷卻，中間部分冷卻不好2皺眉現(xiàn)象由于垂直電泳槽的裝置不合適引起的，特別是當明膠和玻璃板組成的“三明治底部有氣泡”或靠近隔片的凝膠聚

5、合不完全3“拖尾”現(xiàn)象樣品溶解不佳引起解決辦法：加樣前離心選擇合適的樣品緩沖液和凝膠緩沖液加增溶試劑降低凝膠濃度4“紋理”現(xiàn)象樣品中的不溶性顆粒引起的解決辦法：增加溶解度離心除去不溶性顆粒5偏斜現(xiàn)象電極放置不平行或加樣位置偏斜引起6帶太寬加樣量太多或者加樣孔泄露引起THANKYOU!