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《流式細胞術(shù)的質(zhì)量控制》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、流式細胞術(shù)的質(zhì)量控制和影響因素河北省腫瘤研究所 左連富一、標本的采集和固定方法的質(zhì)量控制標本采集是十分重要的環(huán)節(jié)，在標本的采集過程，需注意：①手術(shù)切除的新鮮標本或活檢針吸標本取材時，要避免出血壞死組織。②標本采集后要及時固定或深低溫保存，以免組織發(fā)生自溶，DNA降解，而造成測試結(jié)果的誤差。③固定劑要采用對組織細胞穿透性強的濃度。例如70%的乙醇固定比75%以上的濃度固定效果好，高濃度的乙醇常造成細胞表面快速形成一個蛋白膜，致使細胞內(nèi)的物質(zhì)固定不良，有作者分析研究了自溶對DNA測定的影響，發(fā)現(xiàn)自溶的組織細胞
2、常出現(xiàn)假性異倍體，且不固定的組織細胞隨時間的延長，DNA含量呈梯度降低，根據(jù)檢測的目的，選擇什么類型的固定劑，對流式檢測質(zhì)量也有顯著的影響，例如細胞DNA的分析，使用醇類固定劑較好而不選擇醛類固定劑，醛類固定劑明顯影響細胞DNA熒光發(fā)射強度，實驗證明，醛類固定劑對插入性熒光染料與核酸的結(jié)合有很強的干擾作用，其熒光強度僅相當(dāng)于新鮮組織熒光強度的50-70%左右。如果作流式免疫研究工作，采用新鮮組織是最好的選擇，在不能及時檢測又沒有低溫保存條件時，要根據(jù)所測物質(zhì)在細胞內(nèi)還是在細胞膜表面，在膜表面的抗原物質(zhì)，以
3、醛類固定劑為宜，盡管醛類固定劑產(chǎn)生的非特異性熒光較強，但不宜采用醇類固定劑，因醇類固定劑可使細胞表面的糖蛋白、脂蛋白脫落丟失，失去標記的位點。如所測抗原物質(zhì)在細胞內(nèi)，可以使用醇類固定劑，這種固定方法簡便易行，無需特殊低溫冷凍條件，在一般冰箱(0-4℃)放置即可，能很好的保持細胞形態(tài)和生物化學(xué)成分不發(fā)生變性。二、單細胞懸液制備的質(zhì)量控制人體的末梢血液和骨髓細胞及淋巴組織是人體組織中缺乏細胞間連結(jié)裝置的組織，尤其是血和骨髓細胞是天然的單分散細胞材料，其中的細胞成分在生理狀態(tài)下呈單分散狀態(tài)，它是流式分析最合適的
4、樣品來源，全血中含有多種有形成分，流式細胞檢測是以某一群細胞為檢測對象，因此在檢測前須將所測的某群細胞成分分離出來，例如，以淋巴細胞DNA定量分析為例，就須把淋巴細胞分離出來，而將其他有核細胞或紅細胞去除，對于血小板的分析樣品制備過程中須防止過高離心速度造成血小板膜的損傷，出現(xiàn)血小板凝集。新鮮實體組織單細胞樣品的制備，實體組織是流式分析工作的主要材料來源，但對其分散單細胞樣品的技術(shù)和方法，仍存在著很多問題，仍需大量的探索工作，就目前，國內(nèi)外對實體組織分散單細胞還沒有找到一個適用的又通用方法，甚至同樣組織，
5、用于不同的實驗?zāi)康?，就需要不同的方法處理，或者每一種組織就是一個單獨的問題，因此必須根據(jù)實際情況，去選擇合適有效的單分散方法，選用的方法必須達到細胞產(chǎn)量高，細胞損傷小的目標，但實際工作中達到這個目標是困難的，多年來對于實體組織的分散解聚多采用酶學(xué)法，化學(xué)法、機械物理方法以及低滲脫核方法等，根據(jù)各種組織的特點，以及實驗?zāi)康牡牟煌?，可選擇不同的方法。①選則酶學(xué)方法時，應(yīng)注選擇使用酶類型的問題，含有大量結(jié)締組織的組織器官，選擇膠原酶好，不宜選擇胃蛋白酶或膜酶，并要注意酶的活性條件和影響因素，要注意酶的溶劑，消化
6、時間，pH值，濃度等方面對酶活性的影響，酶學(xué)方法分散組織都有一定的應(yīng)用限制，特別用于流式免疫熒光實驗時，酶處理可能改變或丟失膜的抗原成分，從而影響分析結(jié)果，由于酶學(xué)方法分散下來的細胞產(chǎn)量低，用組織較多，還要注意酶的純度，活性單位，以及生產(chǎn)廠家對酶的污染。②化學(xué)方法，往往單獨應(yīng)用分散組織效果不理想，應(yīng)與酶學(xué)方法綜合使用，分散效果更佳。③機械方法，常采用剪碎，網(wǎng)搓研磨，細針抽吸等，對細胞損傷大，產(chǎn)生的細胞碎片多，細胞團塊多，在使用機械法時，要給于組織適當(dāng)?shù)膲毫?，這種適當(dāng)?shù)膲毫π枰休^多的制樣實踐經(jīng)驗技術(shù)人員來
7、操作。④低滲方法，其溶液是一種低滲液體，造成細胞膜的破壞，使細胞核自行釋放出來，是一個裸核懸液樣品，本方法簡便，可以改變樣品的變異系數(shù)，但要避免脫核時間過長，造成核膨脹碎裂。以上幾種方法是目前對實體組織解聚常用的方法，往往不是單用，常常是一種或二種方法的結(jié)合使用，總的來說，對實體組織分散為單細胞還存在很多困難，因此還需要深入探討流式樣品的制備技術(shù)，制備出完整細胞產(chǎn)量高，細胞損傷小的合格懸液,獲得更好的流式檢測結(jié)果。三、石蠟包埋組織單細胞制備的質(zhì)量控制石蠟包埋組織標本的材料選擇，應(yīng)經(jīng)病理醫(yī)師仔細檢查，選取無
8、自溶，壞死的組織對腫瘤組織標本，選取含腫瘤組織細胞豐富的區(qū)域，且經(jīng)病理形態(tài)或細胞學(xué)核實病理診斷。切取適當(dāng)厚度的石蠟組織片，大量研究證明，切取40-50μm厚度的切片是適宜的，過厚的組織片消化費時，消化下來的細胞數(shù)少，過薄的切片可產(chǎn)生大量的細胞碎片，影響檢測結(jié)果，使腫瘤異倍體的檢出率減少，我們研究了石蠟切片不同厚度(5,10,20,30,40,50μm)對流式分析DNA影響發(fā)現(xiàn)較薄的切片造成碎片較多,噪音增加,組方圖的基線提高,
