殼聚糖固定化胰蛋白酶的研究

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1、萬方數(shù)據(jù)離子交換與吸附，2002，18(2)125～13IIONEXCHANGEANDADSORPTION文章編號(hào)100卜5493(2002)02-0125-07殼聚糖固定化胰蛋白酶的研究+陳天揚(yáng)州大學(xué)理學(xué)院化學(xué)化工系，揚(yáng)州225002摘要：以禿聚糖為栽體，戊二醛為交聯(lián)劑．采用兩種方法特備了固定化胰蛋白酶．考察了固定化反應(yīng)中pH值．戊二醛的濃度、吼及蛤酶量時(shí)固定化胰蛋白酶活力的影響，并研究了這兩種固定化胰蛋白酶的性質(zhì)．實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以戊二醛預(yù)交聯(lián)的網(wǎng)狀殼聚糖為栽體制備的固定化胰蛋白酶具有更加優(yōu)良的性能，

2、在最佳固定化反應(yīng)條件下．酶的活性回收率可速56％．此固定化胰蛋白酶的最連pH為7．¨85、最適溫度為60℃．‰值為2．52moI．tL．固定化腱蛋白醇表現(xiàn)出了較好的熱穩(wěn)定性、pH棼存穩(wěn)定性．殂及在乙醇水溶漶中的穩(wěn)定性．關(guān)鍵詞：殼聚糖胰蛋白醇固定化醇中囤分類號(hào)：06473文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A1前言天然多糖甲殼素的脫乙?；a(chǎn)物一殼聚搪具有良好的生物相容性與生物親和性，它在生物醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用研究正蓬勃開展．它作為生物材料．用作固定化酶、親和層析、金屬螯合親和層折的載體前景十分廣闊【14J。目前研制成功的固定化酶已

3、有上百種．但由于成本昂貴，真正應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)的品種為數(shù)不多。殼聚糖作為開發(fā)應(yīng)用較晚的陽離子型多糖用作固定化酶的載體，在結(jié)構(gòu)上具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)．利用其分子側(cè)鏈上大量的游離氨基，再選擇適當(dāng)?shù)慕宦?lián)劑．可以使得酶麩價(jià)結(jié)合于載體上的反應(yīng)易于進(jìn)行．此外殼聚糖還具有良好的機(jī)械性能、耐熱性、抗菌性等優(yōu)點(diǎn)．胰蛋白酶有著廣泛的用途．但由于其易自消化、穩(wěn)定性較差，它的應(yīng)用受到了一定的限制．考慮到這一特點(diǎn)，選擇溫和的條件制備固定化胰蛋白酶就顯得尤為重要。在本研究中，采用兩種方法制各了殼聚糖固定化胰蛋白酶：～是用線型殼聚糖為載體．

4、直接加入胰蛋白酶和交聯(lián)劑一戊二醛進(jìn)行固定化反應(yīng)：二是用網(wǎng)狀殼聚糖為載體。即先用少量戊二醛將線型殼聚糖預(yù)交聯(lián)成網(wǎng)狀殼聚塘后，再加入胰蛋白酶和一定量的交聯(lián)劑戊二醛進(jìn)行固定化反應(yīng)。第一種方法為常用的以殼聚糖為載體固定化酶的制備方法¨J．而第二種方法尚未見報(bào)道。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明．兩種方法制備得到的固定化胰蛋白酶具有一定的差異．進(jìn)行深入研究后對(duì)比發(fā)現(xiàn)，第二種方法效果更好，特別表現(xiàn)在酶的活性回收率更高及米氏常數(shù)與原t牧聃日期2002年j月22日作者麓卉：陳天．盤'(T96Z-)．江蘇省^．副教授萬方數(shù)據(jù)酶較為接近a此實(shí)

5、驗(yàn)方法也為殼聚糖用于其它酶的固定化提供了又一個(gè)可供選擇的新的操作方法。同時(shí)對(duì)這兩種固定化胰蛋白酶的性質(zhì)進(jìn)行了詳細(xì)的研究，為固定化胰蛋白酶的工業(yè)應(yīng)用提供了非常有用的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。2實(shí)驗(yàn)部分2．1試劑與儀器殼聚糖：自制，脫乙?；葹?5％：戊二醛：E．Merck產(chǎn)品(濃度為25％)；胰蛋白酶：DIFCOLABORTORIES(DETROITMICHIGANUSA)產(chǎn)品：酪蛋白：上?；瘜W(xué)試劑站進(jìn)口分裝；其它試劑均為分折純。53WB微機(jī)型紫外可見分光光度計(jì)(上海光學(xué)儀器廠)：SHZ-82型水浴恒溫振蕩器(江蘇太倉醫(yī)

6、療器械廠)：KJ-l型控溫強(qiáng)磁力攪拌器(蘇北生化儀器廠)；DHS-3型酸度計(jì)(上海第二分析儀器廠)。2．2固定化胰蛋白酶的制備固定化胰蛋白酶A(以線型殼聚糖為載體)：取～定量的殼聚糖溶于2％的乙酸水溶液中，在快速攪拌下，滴加5％的氫氧化鈉水溶液至溶液pH=7．5．抽濾收集沉淀，可得殼聚糖的白色細(xì)小顆粒。將上述經(jīng)過再沉淀處理后的殼聚糖置于0．05mo

7、／L的Tris．Hcl緩沖液(pH=8．o)中，加入一定量的胰蛋白酶攪拌均勻后．再滴加～定量的戊二醛水溶液，在磁力攪拌下反應(yīng)6h。抽濾，先用蒸餾水洗滌，再用

8、上述緩沖液洗滌，直至洗滌液中檢測(cè)不到戊二醛和游離酶，真空干燥后即得顆粒狀固定化酶。固定化胰蛋白酶B(以網(wǎng)狀殼聚糖為載體)：取一定量的殼聚糖溶于t％的乙酸水溶液中，在磁力攪拌下，滴加2％的氨氧化鈉水溶液至溶液pH=5．5后，加入一定量的戊二醛水溶液反應(yīng)1h，然后再在快速攪拌下滴加5％的氫氧化鈉水溶液至溶液pH=7．5，抽濾收集沉淀．可得預(yù)交聯(lián)的網(wǎng)狀殼聚糖的白色細(xì)小顆粒。胰蛋白酶固定化操作方法同上。2．3蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定參照文獻(xiàn)∽采用Lowry法測(cè)定。2．4酶活力的測(cè)定采用Folinl61原理測(cè)定胰蛋白酶和

9、固定化胰蛋白酶的活力。具體方法如下：以2％的酪蛋白為底物．加入一定量的胰蛋白酶稀溶液或固定化胰蛋白酶．在40"C恒溫振蕩lOmin，終止反應(yīng)后取濾液用Folin試劑顯色，測(cè)定其在波長650nm處的吸光度。萬方數(shù)據(jù)第18卷第2期離r交換與吸附．127·3結(jié)果與討論3．1固定化胰蛋白酶最佳條件的確定3．1．1固定化反應(yīng)中pH值對(duì)固定化酶活力的影響固定戊二醛用量和給酶量，采用pH=5．0一lO．0范圍的緩沖液，分別制備固定化胰蛋白酶A和固定化胰蛋