糖化酶的固定化

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1、糖化酶的固定化及其在葡萄糖生產(chǎn)中的應(yīng)用工藝姓名：吳啟華12生物工程1班學(xué)號(hào)：1214200027指導(dǎo)老師：柯德森、姚焱；同組者：嚴(yán)少杰，李海毅；時(shí)間:2015/11/30---2015/12/14摘要：利用有關(guān)固定化酶的理論和方法，研究固定化糖化酶的效率與糖化酶的濃度的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)中測(cè)定固定化糖化酶偶聯(lián)率、相對(duì)活力、活力回收來衡量其生產(chǎn)工藝的優(yōu)劣，并探討糖化酶的濃度對(duì)固定化效果及結(jié)合牢固程度的影響和驗(yàn)證固定化糖化酶催化生產(chǎn)葡萄糖的重復(fù)使用能力及其效率。制備固定化糖化酶的方法為離子吸附法，并且使用DNS法測(cè)定固定化酶的活力。結(jié)果顯

2、示：在該次實(shí)驗(yàn)中，固定化的效果較好；加入20g離子交換劑固定化酶的活力回收為79.1%，偶聯(lián)率為90.46%，相對(duì)活力為82.58%，加入25g離子交換劑固定化酶的活力回收為85.2%，偶聯(lián)率為92.76%，相對(duì)活力為92.54%。重復(fù)使用葡萄糖固定化酶的過程中，固定化酶的利用效率降低。酶與載體的濃度比例較高固定化酶葡萄糖生產(chǎn)效率高。關(guān)鍵詞：固定化，糖化酶，葡萄糖，酶活力1、前言：糖化酶也稱葡萄糖淀粉酶（glucoamylase,EC.3.2.1.3）(淀粉-α-1，4-葡聚糖葡萄糖水解酶)，它能夠催化淀粉液化產(chǎn)物---糊精及低

3、聚糖進(jìn)一步水解成葡萄糖。糖化酶對(duì)底物的作用是由非還原端開始，將α-1，4-鍵和α-1，6鍵逐一水解，酶作用時(shí)糖苷鍵在C1-6間斷裂，所產(chǎn)生的葡萄糖為b構(gòu)型，幾乎100%轉(zhuǎn)變?yōu)槠咸烟?。工業(yè)生產(chǎn)使用的糖化酶主要來自曲霉、根霉及擬內(nèi)孢霉，它被廣泛應(yīng)用于釀酒、制糖等行業(yè)，是非常重要的酶制劑。酶的固定化方法通常按照用于結(jié)合的化學(xué)反應(yīng)的類型進(jìn)行分類，大致有三種：非共價(jià)結(jié)合法（結(jié)晶法、分散法、物理吸附法及離子結(jié)合法）；化學(xué)結(jié)合法（包括共價(jià)結(jié)合法及交聯(lián)法）；包埋法（包括微囊法及網(wǎng)絡(luò)法）。本實(shí)驗(yàn)利用離子結(jié)合法制備固定化糖化酶。離子結(jié)合法就是酶通過

4、離子鍵結(jié)合于具有離子交換基的不溶性載體的固定化方法，常用的載體有：葡聚糖凝膠、離子交換樹脂、纖維素等。本實(shí)驗(yàn)以離子交換樹脂為載體，應(yīng)用離子交換結(jié)合法制備固定化酶，該法操作簡便，處理?xiàng)l件溫和，酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)和活性中心的氨基酸殘基不易被破壞，酶的活性回收率高，可反復(fù)連續(xù)生產(chǎn)，對(duì)稀酶有濃縮作用，載體可再生使用。其缺點(diǎn)是：載體和酶的結(jié)合力弱，容易受緩沖液種類或pH的影響，在高離子強(qiáng)度下進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，酶易從載體上脫落。使用共價(jià)結(jié)合法不會(huì)使酶容易脫落，國外研究者已研究出用氧化鋯涂層多孔玻璃或多孔陶瓷，然后硅烷化，最后用重氮基、醛基和異硫氰基衍生

5、物偶聯(lián)糖化酶，結(jié)果使酶活較高，并且能連續(xù)生產(chǎn)3個(gè)酶半衰期。在此次實(shí)驗(yàn)中還使用用DNS法測(cè)定固定化酶、殘留酶、原酶的活力。2、材料與方法：2.1材料：（1）糖化酶液，GF-201大孔強(qiáng)堿陰離子交換劑，葡萄糖，可溶性淀粉(20g/L)，CuSO4.5H2O，次甲基蘭，酒石酸鉀鈉，氫氧化鈉，亞鐵氰化鉀，乙酸，乙酸鈉(9/9配制pH4.6緩沖液)，無水乙醇，鹽酸。硫代硫酸鈉（0.05M），碘溶液（次碘酸鈉，0.1M）。硫酸2M。（2）酶液、固定化酶及固定化后的殘留酶液2.2實(shí)驗(yàn)儀器：恒溫水浴鍋（可達(dá)99℃，5個(gè)），酸度計(jì)（3個(gè)），容量瓶

6、，量筒，燒杯，移液管，比色管，漏斗，玻璃棒，錐形瓶，試管架，吸耳球，pH試紙，濾紙，離心機(jī)，離心管，分光光度計(jì)等。2.3試劑：（1）標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液（1mg/mL）：精確稱取100mg葡萄糖，用蒸餾水溶解并定容至100mL。（2）3,5-二硝基水楊酸試劑：精確稱取3,5-二硝基水楊酸1g，溶于20mL2mol/LNaOH溶液中，加入50mL蒸餾水，再加入30g酒石酸鉀鈉，待溶解后用蒸餾水定容至100mL。蓋緊瓶塞，勿使CO2進(jìn)入。若溶液混濁可過濾后使用。（3）0.1mol/LpH5.6的檸檬酸緩沖液A液：（0.1mol/L檸檬酸）

7、：稱取C6H8O7·H2O21.01g，用蒸餾水溶解并定容至1L。B液：（0.1mol/L檸檬酸鈉）：稱取Na3C6H5O7·2H2O29.41g，用蒸餾水溶解并定容至1L。取A液55mL與B液145mL混勻，既為0.1mol/LpH5.6的檸檬酸緩沖液。（4）1%淀粉溶液：稱取1g淀粉溶于100mL0.1mol/LpH5.6的檸檬酸緩沖液中。2.4操作步驟：2.4.1.試劑的配制：糖化酶液：市售商品化糖化酶,去離子pH7的磷酸緩沖液配制，根據(jù)標(biāo)稱的活力單位配制為1萬單位/ml的溶液，離心去除不溶性雜質(zhì)，共配4000ml,4℃?zhèn)?/p>

8、用。2mol/L氫氧化鈉：8gNaOH-----100ml,共配3000ml，2mol/LHCL:17ml濃鹽酸------100ml，共配3000ml，2.4.2．固定化酶實(shí)驗(yàn)步驟：載體的預(yù)處理：A：乙醇處理：15克濕離子交換劑---50ml燒杯加入30ml去