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《轉(zhuǎn)基因成分PCR定性檢測(cè)技術(shù)》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫(kù)。
1、種子轉(zhuǎn)基因成分PCR定性檢測(cè)技術(shù)種子轉(zhuǎn)基因成分PCR定性檢測(cè)技術(shù)將不同來(lái)源的DNA分子進(jìn)行重組，克服了天然物種生殖隔離的屏障，將具有某種特性的基因分離和克隆，再轉(zhuǎn)接到另外的生物細(xì)胞內(nèi)。轉(zhuǎn)基因可以按照人們的意愿使生物體的遺傳性狀發(fā)生改變，創(chuàng)造出自然界中原來(lái)并不存在的新的生物功能和類型。是指遺傳物質(zhì)基因被改變的生物，其基因改變的方式是通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)，而不是以自然增殖或自然重組的方式產(chǎn)生。簡(jiǎn)稱：GMOs非轉(zhuǎn)基因油菜噴施草甘膦前抗草甘膦油菜RT73噴施草甘膦后返回中國(guó)培育的轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻Bt63v植物轉(zhuǎn)基因方法花粉管通道法在授粉后向子房
2、注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在開(kāi)花、受精過(guò)程中形成的花粉管通道，將外源DNA導(dǎo)入受精卵細(xì)胞，并進(jìn)一步地被整合到受體細(xì)胞的基因組中，隨著受精卵的發(fā)育而成為帶轉(zhuǎn)基因的新個(gè)體。該方法于20世紀(jì)80年代初期由我國(guó)學(xué)者周光宇提出，我國(guó)目前推廣面積最大的轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉就是用花粉管通道法培育出來(lái)的。轉(zhuǎn)入的基因調(diào)控元件：?jiǎn)?dòng)子、終止子、內(nèi)含子、增強(qiáng)子等；標(biāo)記基因：hpt基因，NptII基因，GUS基因等；目的基因：抗蟲(chóng)性狀的cry系列基因、抗除草劑性狀的EPSPS基因、PAT基因、BAR基因等。P35STerminatorMon810玉米
3、IntronHSP-CryAbP35STerminator其他Bt玉米轉(zhuǎn)基因作物的研究最早始于20世紀(jì)八十年代，1983年全球第一例轉(zhuǎn)基因植物在美國(guó)問(wèn)世，1987被允許進(jìn)入田間鑒定試驗(yàn)，1992年開(kāi)始大田產(chǎn)量試驗(yàn)，1995年完成安全性評(píng)價(jià)研究，1996年在美國(guó)最早開(kāi)始商業(yè)化生產(chǎn)，當(dāng)年種植面積174萬(wàn)公頃。據(jù)“農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用國(guó)際服務(wù)組織（ISAAA）”2011年3月7日發(fā)布的年度報(bào)告稱：2010年，共有29個(gè)國(guó)家種植了1.48億公頃轉(zhuǎn)基因作物；1996年到2010年，全球轉(zhuǎn)基因作物累計(jì)種植面積超過(guò)10億公頃。2010年中國(guó)種植轉(zhuǎn)
4、基因作物面積達(dá)350萬(wàn)公頃，排名世界第六，其中轉(zhuǎn)基因棉花330萬(wàn)公頃，其余是轉(zhuǎn)基因木瓜，轉(zhuǎn)基因番茄，轉(zhuǎn)基因辣椒等。截止目前，中國(guó)共批準(zhǔn)發(fā)放7種轉(zhuǎn)基因植物的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全證書(shū)，耐貯存番茄、抗蟲(chóng)棉花、改變花色的牽?；?、抗病的辣椒、抗病的番木瓜、抗蟲(chóng)水稻、轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米。v轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法分類生物化學(xué)測(cè)定法蛋白質(zhì)分析法v轉(zhuǎn)基因成分PCR定性檢測(cè)DNA提取PCR擴(kuò)增v轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法分類1.掌握檢測(cè)對(duì)象的基本信息。如DNA或蛋白水平檢測(cè)，要了解轉(zhuǎn)基因植物插入的DNA序列信息及表達(dá)情況；2.須有針對(duì)特定核酸或蛋白的檢測(cè)方法。如DNA水平
5、檢測(cè)的引物、探針和蛋白水平檢測(cè)的抗體等；3.檢測(cè)必須使用標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)。作為轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)中的對(duì)照、用于制作轉(zhuǎn)基因定量分析的標(biāo)準(zhǔn)曲線、不同實(shí)驗(yàn)室之間結(jié)果比較的重要參考。轉(zhuǎn)基因檢測(cè)工作流程樣品DNA提取PCR擴(kuò)增電泳分析陽(yáng)性陰性檢出GMO成分未檢出GMO成分檢測(cè)步驟vDNA提取vPCR擴(kuò)增v電泳分析vDNA提取vPCR擴(kuò)增1、引物：用TE緩沖液（pH8.0）或雙蒸水將引物稀釋到10μmol/L?！浴掇r(nóng)業(yè)部953號(hào)公告－6－2007》檢測(cè)基因引物引物序列(5’-----3’)PCR產(chǎn)物大小(bp)Primer1SPS-F1:TTG
6、CGCCTGAACGGATATSPS277Primer2SPS-R1:GGAGAAGCACTGGACGAGGPrimer135S-F1:GCTCCTACAAATGCCATCATTGCCaMV35SPrimer219535S-R1:GATAGTGGGATTGTGCGTCATCCCPrimer1NOS-F1:GAATCCTGTTGCCGGTCTTGNOS180Primer2NOS-R1:TTATCCTAGTTTGCGCGCTAPrimer1Bt-F1:GAAGGTTTGAGCAATCTCTACBt301Primer2Bt-R1:CG
7、ATCAGCCTAGTAAGGTCGT2、設(shè)置對(duì)照在試樣PCR反應(yīng)的同時(shí)，應(yīng)設(shè)置陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照。設(shè)置兩個(gè)陰性對(duì)照：用非轉(zhuǎn)基因玉米材料中提取的DNA作為PCR反應(yīng)體系的模板；設(shè)置兩個(gè)陽(yáng)性對(duì)照，用轉(zhuǎn)Bt基因玉米含量為1%的玉米DNA作為PCR反應(yīng)體系的模板；設(shè)置一個(gè)空白對(duì)照：用無(wú)菌重蒸水作為PCR反應(yīng)體系的模板3、反應(yīng)體系制備1）體系制備。一組樣品(包括樣品/陽(yáng)性/陰性/空白對(duì)照)的體系要一起制備，每個(gè)試樣2次重復(fù)。取1.5ml離心管，按照表A.2給出的順序依次加入試劑。在配制反應(yīng)體系時(shí)所有的試劑都應(yīng)置于冰上。用移液器
8、輕輕混合反應(yīng)體系并輕微離心！PCR反應(yīng)體系（不包含模板DNA）試劑終濃度單樣品體積10樣品體積ddH2O14.375μl143.75μl10×PCR緩沖液1×2.5μl25μl25mmol/LMgCl22.5mmol/L2.5μl25μldNTPs0.2mmol
