PCR和定量PCR的引物和探針設(shè)計(jì)

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1、引物和探針設(shè)計(jì)–PCR和定量PCR目錄基本原理1引物設(shè)計(jì)的重要因素2針對(duì)特殊應(yīng)用的其他提示4引物的質(zhì)量和純度7基本原理基本原理引物是短的寡核苷酸，充當(dāng)DNA復(fù)制的起始點(diǎn)。因?yàn)閹缀跛蠨NA聚合酶都不能從頭合成，所以它們需要一個(gè)3'-羥基作為DNA合成的起始點(diǎn)。這個(gè)3'-羥基由相配的引物提供。引物在體內(nèi)由RNA聚合酶（稱為引物酶）生成。這些引物（在此為小RNA）由DNA聚合酶用作延長(zhǎng)的起始點(diǎn)。在延長(zhǎng)過(guò)程中，RNA引物降解并由DNA取代。體外擴(kuò)增反應(yīng)，如聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）或逆轉(zhuǎn)錄（RT），需要引物。通過(guò)選擇特異的引物序列，DNA片段的所需區(qū)域可得到擴(kuò)增。對(duì)于大多數(shù)PCR

2、反應(yīng)，決定整個(gè)反應(yīng)成功與否的最重要因素是引物的序列和質(zhì)量。在開(kāi)始引物設(shè)計(jì)之前，必須弄清以下幾點(diǎn)：PCR的目的（例如定量檢測(cè)、克隆、基因分型）PCR類型（定量PCR、RT-PCR、長(zhǎng)片段PCR)樣品材料（基因組DNA、RNA、微小RNA）可能的問(wèn)題（例如假基因、SNP)1引物設(shè)計(jì)的重要因素引物設(shè)計(jì)的重要因素有一些不同的軟件工具可用于引物設(shè)計(jì)和序列分析。它們能簡(jiǎn)化相配引物對(duì)的搜索，一般考慮以下標(biāo)準(zhǔn)。最流行的軟件為Primer3(http://primer3.sourceforge.net)，它是大多數(shù)基于網(wǎng)絡(luò)引物設(shè)計(jì)應(yīng)用的基礎(chǔ)。引物長(zhǎng)度和專一性典型的引物長(zhǎng)度為18-30個(gè)堿

3、基。短的引物（15個(gè)核苷酸以下）能非常高效地結(jié)合---但是它們的專一性不夠。非常長(zhǎng)的引物能提高專一性，但是退火效率低，從而導(dǎo)致PCR產(chǎn)物量低下。應(yīng)避免編碼單一序列和重復(fù)序列的引物。平衡GC含量，避免GC-和AT-富集區(qū)域引物的GC含量應(yīng)介于40%和60%之間。應(yīng)避免聚-（dC）-或聚（dG）-區(qū)域，因?yàn)樗鼈儠?huì)降低退火反應(yīng)的專一性。聚-（dA）-和聚（dT）-也應(yīng)避免，因?yàn)檫@會(huì)生成不穩(wěn)定的引物-模板復(fù)合物，從而降低擴(kuò)增效率。退火溫度退火溫度是基于引物的解鏈溫度（Tm）計(jì)算。最常用的解鏈溫度計(jì)算公式顯示如下?！?+4”法則，亦稱華萊士法則，對(duì)于極短的寡核苷酸（最多14個(gè)堿基

4、）有效，該法則提出每個(gè)AT對(duì)能將雙鏈DNA的解鏈溫度提高2°C，每個(gè)GC對(duì)則能提高4°C。Tm=2°C?(A+T)+4°C?(G+C)GC法則（適用于長(zhǎng)于13個(gè)堿基的序列）也是一種簡(jiǎn)單但同時(shí)相當(dāng)不準(zhǔn)確的方法。(G+C-16.4)Tm=64.9°C+41°C?(A+T+G+C)兩種法則都假設(shè)退火發(fā)生于以下標(biāo)準(zhǔn)條件下：50nM引物、50mMNa+和pH7.0?！胞}調(diào)整”法稍微準(zhǔn)確一些，考慮到了反應(yīng)緩沖液中的Na+離子濃度。C+G820+Tm=100.5°C+41°C??16.6?log10([Na])A+C+G+TA+C+G+T最復(fù)雜的方法稱為“堿基堆積”法。這里的計(jì)算中包

5、括了雜交期間的焓（H）和熵（S）。計(jì)算出的解鏈溫度可用于估算最佳退火溫度。但是，經(jīng)常需要經(jīng)驗(yàn)性地估算最佳溫度。提示所選引物的解鏈溫度應(yīng)允許退火溫度介于55°C和65°C之間。一個(gè)引物對(duì)的兩條引物都應(yīng)具有相同或極相近的解鏈溫度。2引物設(shè)計(jì)的重要因素避免互補(bǔ)的引物序列引物設(shè)計(jì)應(yīng)避免一條引物內(nèi)的互補(bǔ)性超過(guò)3個(gè)堿基。如果不遵循這個(gè)法則，那么可能出現(xiàn)使引物不能與其目標(biāo)序列結(jié)合的二級(jí)結(jié)構(gòu)。引物之間的同源性也應(yīng)避免，尤其在作為擴(kuò)增起始點(diǎn)和關(guān)鍵區(qū)域的3'端。同源性將導(dǎo)致強(qiáng)引物二聚體形成，后者將與所需要的PCR反應(yīng)競(jìng)爭(zhēng)資源，導(dǎo)致PCR效率降低，在極端情況下，甚至導(dǎo)致完全無(wú)特異性PCR產(chǎn)物

6、生成（圖1）。A5’ACGGATACCATGCCTATG3’5’ACGGATACCATGCCTATG3’B5’ACTTGCATGTCTAGTCAC3’3’CAGTGAGTTACATGACTG5’圖1因一條引物內(nèi)（A）和兩條引物之間（B）的互補(bǔ)性而形成引物二聚體。3’-序列應(yīng)小心避免在退火步驟期間將PCR引物的3'端錯(cuò)配。3'端為G-或C-核苷酸較好，因?yàn)槟茉黾咏Y(jié)合強(qiáng)度。同時(shí)它將提高PCR效率，因?yàn)橐?模板符合物的開(kāi)放將達(dá)到最小。但是，超過(guò)3個(gè)G/C堿基將會(huì)具有負(fù)面效果，因?yàn)闀?huì)降低反應(yīng)的專一性。3針對(duì)特殊應(yīng)用的其他提示針對(duì)特殊應(yīng)用的其他提示逆轉(zhuǎn)錄(RT-PCR)對(duì)于RT

7、-PCR，例如基因表達(dá)分析，推薦采用mRNA特異性引物對(duì)，以避免或識(shí)別基因組DNA擴(kuò)增。可選擇兩種方法（圖2）。首先，引物可設(shè)計(jì)用于在內(nèi)含子序列前后兩個(gè)不同的外顯子之間結(jié)合（圖2A）。在這種情況下，所產(chǎn)生的基因組DNA來(lái)源PCR片段將遠(yuǎn)大于mRNA來(lái)源者。根據(jù)內(nèi)含子的長(zhǎng)度，可以縮短聚合時(shí)間，這樣將不會(huì)合成長(zhǎng)片段。但是，基因組DNA的擴(kuò)增會(huì)消耗資源，從而降低所需要的mRNA擴(kuò)增的效率。另一個(gè)推薦方法是設(shè)計(jì)跨越mRNA上外顯子-外顯子聯(lián)合而結(jié)合的引物。這可以預(yù)防基因組DNA的擴(kuò)增（圖2B）。APCRproductIntron1GenomicD