基因啟動子分析基本流程

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1、2008年螺旋講堂第十一課----“基因啟動子分析基本流程”“螺旋課堂”2008年第十一課----“基因啟動子分析基本流程”螺旋親愛的螺友們好，大家好！歡迎光臨螺旋講堂，很高興有機(jī)會和大家相聚螺旋網(wǎng)，讓我們一同在討論中學(xué)習(xí)，在交流中成長！分子生物學(xué)發(fā)展迅猛，新方法新技術(shù)新發(fā)現(xiàn)層出不窮，但是我想,我們的基礎(chǔ)研究從某種意義上來說，可以簡單的分為兩大部分，一個(gè)是基因的表達(dá)，另一個(gè)是基因的功能。當(dāng)然，這個(gè)基因的概念現(xiàn)在已經(jīng)不僅僅是指編碼蛋白的核苷算序列了。我們這期主要探討基因的表達(dá)。而轉(zhuǎn)錄調(diào)控在基因表達(dá)中占有很重要的地位?；虻霓D(zhuǎn)錄

2、調(diào)控機(jī)制非常復(fù)雜，這些理論有機(jī)會我們再詳細(xì)探討，這里就不多介紹了，我們主要談一下對于一個(gè)新的基因，如何開始他的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究，第一步到底該怎么做呢？這里提供一些簡單的入門級別的方法，希望對大家有用。相信還有更多更好更實(shí)用的方法，也希望螺友們能夠拿出來和大家分享，共同進(jìn)步！本次講座共分為五個(gè)部分主要是講第一部分,因?yàn)檫@個(gè)一般的文獻(xiàn)和書籍都很少有詳細(xì)說明.一：克隆目的基因基本啟動子序列我們都知道，基因的基本啟動子一般是在基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游，當(dāng)一個(gè)基因在沒有確定其轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的時(shí)候，我們假定NCBI上提交的序列就是他的完整轉(zhuǎn)錄本，

3、那么他的第一個(gè)堿基就是他的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。而基因的基本啟動子一般就是在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的上游2000bp左右和下游200bp左右，當(dāng)然,這個(gè)是一般情況,具體問題還要具體分析.尤其現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)一般的基因都是有幾個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的.我們通過該基因mRNA序列和基因組序列BLAST，就能夠在染色體上找到這段基因組序列。我這里用human的AGGF1基因做個(gè)例子給大家具體演示一下.2008年螺旋講堂第十一課----“基因啟動子分析基本流程”1首先需要在NCBI里面查找到AGGF1基因的mRNA序列,這個(gè)我想大家都應(yīng)該很清楚,如下圖.2008年螺

4、旋講堂第十一課----“基因啟動子分析基本流程”2然后就是用這段mRNA序列和人類的基因組序列BLAST3BLAST得到了很多結(jié)果，我們往往選擇最上面那個(gè)最匹配的結(jié)果。2008年螺旋講堂第十一課----“基因啟動子分析基本流程”4點(diǎn)擊之后就可以看到下圖，這個(gè)基因的14個(gè)外顯子和13個(gè)內(nèi)含子在5號染色體上的位置一目了然，第一個(gè)外顯子在上面，說明這個(gè)基因在染色體上是正向的，基本啟動子就應(yīng)該在第一外顯子上面，我用紅色的方框標(biāo)明了。2008年螺旋講堂第十一課----“基因啟動子分析基本流程”5大家有沒有注意到左上方有個(gè)數(shù)據(jù)框，可以適

5、當(dāng)放大你的核心區(qū)域，我把數(shù)值改為76,360K到76,362.200,剛好2200BP,包括了第一個(gè)外顯子的前200BP左右.然后點(diǎn)擊紅色框標(biāo)明的Download/viewsequence.6然后就到了這個(gè)界面,SequenceFormat選擇GenBank,然后點(diǎn)擊Display.就得到我們所需要的序列了.2008年螺旋講堂第十一課----“基因啟動子分析基本流程”7這里我們可以看到1989到2201是AGGF1的mRNA序列,說明我們的確找到了該基因5'非翻譯區(qū)的上游啟動子序列.建議將這2200bp都克隆下來..2008

6、年螺旋講堂第十一課----“基因啟動子分析基本流程”以上的步驟就是基因基本啟動子的查找,其實(shí)還有很多調(diào)控序列是在基因內(nèi)含子區(qū)域或者是基因的3'非翻譯區(qū)等,序列查找的步驟和上面是一樣的.8還有一個(gè)方法更加簡單,那就是用AGGF1的前60bp序列和nucleotide數(shù)據(jù)庫BLAST,可以得到該序列在染色體上的位置,需要注意的是,如果是反向的序列的話,我們就要選擇反向互補(bǔ)的序列.2008年螺旋講堂第十一課----“基因啟動子分析基本流程”相信大家在使用的過程中會有更多的發(fā)現(xiàn).二：軟件預(yù)測順式作用元件，做點(diǎn)突變分析得到這些序列后,

7、克隆進(jìn)沒有啟動子載體pGL3或者pTAL-luc中去，轉(zhuǎn)染細(xì)胞,測定熒光活性，如果有很強(qiáng)的活性,那么說明你已經(jīng)成功克隆到了該基因的基本啟動子.然后可以通過5‘非翻譯區(qū)一系列的缺失突變，不斷把范圍縮小,找到哪一段序列對于該基因的啟動子活性是必須的或者是最重要的。當(dāng)找到這個(gè)比較核心的啟動子序列后，可以通過一些在線的軟件去預(yù)測其順式作用元件的位點(diǎn),,每個(gè)在線軟件都有自己獨(dú)特的算法分析,得到的結(jié)果并不都是可靠的,每個(gè)軟件都有自己的優(yōu)勢，需要多綜合一些軟件預(yù)測的結(jié)果,并通過分析預(yù)測出來的轉(zhuǎn)錄因子是不是和該基因有功能上的聯(lián)系等做進(jìn)一步的

8、選擇，繼續(xù)做下面的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。下面這兩個(gè)有商業(yè)化的軟件，有條件的朋友可以用。http://www.genomatix.de/http://www.gene-regulation.com/pub/databases.html#transfac下面這兩個(gè)是免費(fèi)的，用起來很方便。http://ww