引物設(shè)計(jì)的原理與方法

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1、PCR引物設(shè)計(jì)的原理及方法閻振鑫S111666(四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)成都610014)摘要：自20世紀(jì)后期發(fā)展了PCR技術(shù)以來(lái)，PCR已經(jīng)改變了整個(gè)生物學(xué)研究的進(jìn)程。而PCR反應(yīng)的第一步就是設(shè)計(jì)引物，引物設(shè)計(jì)的好壞直接關(guān)系到PCR的成敗。PCR引物設(shè)計(jì)有許多的原則必須要遵循：引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，引物與模板的序列要緊密互補(bǔ)。引物不能在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNA聚合反應(yīng)等。另外，引物的設(shè)計(jì)方法也越來(lái)越多，出現(xiàn)了許多專門(mén)的設(shè)計(jì)軟件和網(wǎng)站，如：PrimerPremier5.0等。關(guān)鍵詞：PCR引物原理方法NCBIPrimerPremier5.0PCRpr

2、imerdesignprincipleandmethodYanZhenxin(sichuanUnivercity,Lifesciencecollegecellbiologychengdu610014)Abstract:WhenPCRtechnologywasfind,PCRhaschangedalloftheprograminresearchofbiology.ThedesignofprimeristhefriststepofPCR.ItisrelationtothefateofPCR.Therearesomeprincipalsmustbeobey:dipolymerandhai

3、rpinstructuremustbeavoidbetweendifferentprimers.TheDNApolymerizationreactionshouldnotbetriggeredatthewrongsite.Therefore,therearemoreandmoremethodsofdesignprimer,includetheprofessionalsoftwaresandprofessionalwebsite.Keyword:PCRprimerprincipleNCBIPrimerPremier5.0聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerasechainreaction。

4、PCR)是20世紀(jì)后期發(fā)展起來(lái)的一種體外擴(kuò)增特異DNA片斷的技術(shù)。具有快速、簡(jiǎn)便及高度敏感等優(yōu)點(diǎn)，能極大地縮短目的基因擴(kuò)增時(shí)間[1]。因此，其一直是生物學(xué)者們致力于構(gòu)建cDNA文庫(kù)、基因克隆以及表達(dá)調(diào)控研究的必要前提和基礎(chǔ)[2]。PCR的第一步就是引物設(shè)計(jì)。引物設(shè)計(jì)的好壞，直接影響了PCR的結(jié)果，因此這一步很關(guān)鍵。成功的PCR反應(yīng)既要高效，又要特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，因此對(duì)引物設(shè)計(jì)提出了較高的要求。引物設(shè)計(jì)需要注意的地方很多，在大多數(shù)情況下，我們都是在知道已知模板序列時(shí)進(jìn)行PCR擴(kuò)增的。在某些情況比如構(gòu)建文庫(kù)的時(shí)候也會(huì)在不知道模板序列的情況下進(jìn)行設(shè)計(jì)。這個(gè)時(shí)候隨機(jī)核苷酸序列就與模板不是完全

5、匹配。我們通常指的設(shè)計(jì)引物都是在已知模板序列的情況下進(jìn)行。設(shè)計(jì)的目的是在兩個(gè)目標(biāo)間取得平衡：擴(kuò)增特異性和擴(kuò)增效率。1PCR引物設(shè)計(jì)的原則PCR引物設(shè)計(jì)的目的是為了找到一對(duì)合適的寡核苷酸片段，其中在擴(kuò)增的DNA片斷5'端的引物對(duì)應(yīng)于有意鏈DNA序列，3'端的引物對(duì)應(yīng)于無(wú)意鏈DNA序列，使其能有效地?cái)U(kuò)增模板DNA序列。因此，引物的優(yōu)劣直接關(guān)系到PCR的特異性與成功與否。要設(shè)計(jì)引物首先要找到DNA序列的保守區(qū)。同時(shí)應(yīng)預(yù)測(cè)將要擴(kuò)增的片段單鏈?zhǔn)欠裥纬啥?jí)結(jié)構(gòu)。如這個(gè)區(qū)域單鏈能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，就要避開(kāi)它。如這一段不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，那就可以在這一區(qū)域設(shè)計(jì)引物?，F(xiàn)在可以在這一保守區(qū)域里設(shè)計(jì)一對(duì)引物。

6、一般引物長(zhǎng)度為15~30堿基，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為100~600堿基對(duì)。我們先看P1引物。一般引物序列中G+C含量一般為40%~60%。而且四種堿基的分布最好隨機(jī)。不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。否則P1引物設(shè)計(jì)的就不合理。應(yīng)重新尋找區(qū)域設(shè)計(jì)引物。同時(shí)引物之間也不能有互補(bǔ)性，一般一對(duì)引物間不應(yīng)多于4個(gè)連續(xù)堿基的互補(bǔ)。引物確定以后，可以對(duì)引物進(jìn)行必要的修飾，例如可以在引物的5′端加酶切位點(diǎn)序列；標(biāo)記生物素、熒光素、地高辛等，這對(duì)擴(kuò)增的特異性影響不大。但3′端絕對(duì)不能進(jìn)行任何修飾，因?yàn)橐锏难由焓菑?′端開(kāi)始的。這里還需提醒的是3′端不要終止于密碼子的第3位，因?yàn)槊艽a子第3位易發(fā)生簡(jiǎn)并，會(huì)影響擴(kuò)增

7、的特異性與效率。我們可以歸納一下幾條PCR引物的設(shè)計(jì)原則：1.1避免二聚體與發(fā)夾結(jié)構(gòu)引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，引物與模板的序列要緊密互補(bǔ)。引物設(shè)計(jì)中，特別需要判斷引物互補(bǔ)配對(duì)情況是否影響模板與引物的結(jié)合，這需要估計(jì)模板與引物結(jié)合及引物配對(duì)結(jié)合的自由能。A、T由2個(gè)氫鍵連接，G、C由3個(gè)氫鍵連接。一般來(lái)說(shuō)。出現(xiàn)3個(gè)堿基的序列互補(bǔ)便有些危險(xiǎn)，尤其在引物3末端。若3末端出現(xiàn)3個(gè)堿基的序列互補(bǔ)或堿基為GC的2個(gè)堿基的序列互補(bǔ)。只好將這個(gè)引物放棄，重新設(shè)計(jì)[