“產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選”設(shè)計(jì)方案

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1、產(chǎn)淀粉酶（α-淀粉酶）細(xì)菌菌株篩選一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?.掌握從環(huán)境中采集樣品并從中分離純化某種微生物的完整操作步驟。2.鞏固以前所學(xué)的微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)。3.學(xué)習(xí)淀粉酶活性的測(cè)定方法。二、實(shí)驗(yàn)原理：1.α-淀粉酶是一種液化型淀粉酶，它的產(chǎn)生菌芽孢桿菌，廣泛分布于自然界，尤其是在含有淀粉類物質(zhì)的土壤等樣品中。2.從自然界篩選菌種的具體做法，大致可以分成以下四個(gè)步驟：采樣、富集培養(yǎng)、初步篩選、分離純化和性能測(cè)定。a)采樣：即采集含菌種的樣品采集含菌樣品前應(yīng)調(diào)查研究一下自己打算篩選的微生物在哪些地方分布最多，然后才可著手做各項(xiàng)具體工作。在土壤中幾乎各種微生物都可以找到，因而土壤可說(shuō)是微生物的大本營(yíng)。例如

2、廚房土壤、面粉加工廠和菜園土壤中淀粉的分解菌較多。b)富集培養(yǎng)：富集培養(yǎng)就是在所采集的土壤等含菌樣品中加入某些物質(zhì)，并創(chuàng)造一些有利于待分離微生物生長(zhǎng)的其他條件，使能分解利用這類物質(zhì)的微生物大量繁殖，從而便于我們從其中分離到這類微生物。c)初步篩選：i.（選擇培養(yǎng)基）初篩使用選擇培養(yǎng)基對(duì)菌種進(jìn)行培養(yǎng)，通過(guò)培養(yǎng)基的特殊成分，來(lái)篩選出目的菌種，從而進(jìn)行培養(yǎng)。ii.（鑒別培養(yǎng)基）初篩利用鑒別培養(yǎng)基，通過(guò)添加一些特殊的試劑或成分來(lái)鑒別出目的菌種，從而篩選出來(lái)并對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)。d)分離純化：通過(guò)上述的篩選只能說(shuō)我們要分離的目的菌種已經(jīng)存在，但還要把夾雜在其中的雜菌除去，從而得到純種的菌落。純種分離的方法很

3、多，主要有：平板劃線分離法、稀釋分離法、單孢子或單細(xì)胞分離法、菌絲尖端切割法等。e)性能測(cè)定：分離純化得到的菌種之后，所分得的菌種是否具有實(shí)驗(yàn)所要求的性能，還必須要進(jìn)行性能測(cè)定后才能決定取舍。三、實(shí)驗(yàn)材料：1.培養(yǎng)基配制：a)培養(yǎng)基按以下比例配制后，加蒸餾水調(diào)至100%；b)富集培養(yǎng)基：可溶性淀粉1%、蛋白胨1%、葡萄糖0.5%、NaCl0.5%、牛肉膏0.5%、pH7.0；c)分離培養(yǎng)基：玉米粉2%、黃豆餅粉1.5%、瓊脂粉0.8%、CaCl0.02%、MgSO40.02%、NaCl0.25%、K2HPO40.2%、檸檬酸鈉0.2%、硫酸銨0.075%（溶解后加入）、Na2HPO40.2%

4、、pH7.0。2.主要試劑和溶液的配制：a)2%淀粉溶液：準(zhǔn)確稱取淀粉2g溶于100ml0.1mol/LpH5.6的檸檬酸緩沖液中。b)0.1mol/L的檸檬酸緩沖液、pH=1.0的鹽酸a)1%的3，5-二硝基水楊酸：精確稱取1g3，5-二硝基水楊酸，溶于20ml2mol/L氫氧化鈉溶液中，加入蒸餾水50ml，再加入四水酒石酸鉀鈉30g，待溶解后用蒸餾水定容100ml，蓋緊瓶塞，隔絕CO2。b)0.1%葡萄糖溶液：準(zhǔn)確稱取80℃烘干至恒重的無(wú)水葡萄糖0.1g，去離子水溶解后定容至100ml。c)0.1%標(biāo)準(zhǔn)麥芽糖溶液：稱取麥芽糖100mg，用蒸餾水溶解并定容至100ml。二、實(shí)驗(yàn)方法：1.采

5、樣與稀釋：a)從實(shí)驗(yàn)樓前的小樹(shù)林中采集土樣，稱取5g土樣，放入裝有45mL無(wú)菌水的三角瓶中,震蕩20min后靜置5min。然后對(duì)其進(jìn)行濃度梯度稀釋到10-6,分別稀釋到10-4、10-5、10-6濃度下。2.富集培養(yǎng)：a)從上述土壤稀釋液中各取1mL注入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，然后倒入滅菌并融化冷卻至50℃左右的富集培養(yǎng)基，小心搖動(dòng)冷凝后，倒置于37℃保溫箱中培養(yǎng)24小時(shí)。3.初步篩選：a)培養(yǎng)24小時(shí)后，取出平板，向平板中注入1滴革蘭氏碘液，因淀粉遇碘變藍(lán)色，如菌落周圍有無(wú)色透明圈，說(shuō)明該菌能分解淀粉，即該菌株可以產(chǎn)生淀粉酶。通過(guò)影印法或點(diǎn)種法將可以產(chǎn)生淀粉酶的菌株接種到相同的無(wú)菌培養(yǎng)中，重復(fù)操

6、作進(jìn)行培養(yǎng)。4.分離純化：a)初篩所得的菌落中選擇菌落周圍透明圈和菌落直徑之比值較大的菌落，進(jìn)行劃線分離。將劃線分離后的培養(yǎng)皿放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。5.性能測(cè)定：a)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：i.取7支20ml預(yù)先潔凈滅菌干燥的試管，編號(hào)，加入試劑見(jiàn)表1。每個(gè)濃度做3個(gè)平行樣本。搖勻，至沸水浴中煮沸5min。取出后流水冷卻，加蒸餾水定容至20ml，以1號(hào)管作為空白調(diào)零點(diǎn)，在520nm的波長(zhǎng)下比色測(cè)定吸光度值，并建立通過(guò)吸光度值求麥芽糖含量的回歸方程。表1淀粉酶標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作試管號(hào)麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)液（ml）麥芽糖含量（mg）蒸餾水（ml）3，5-二硝基水楊酸（ml）1002.02.020.20.21

7、.82.030.60.61.42.041.01.01.02.051.41.40.62.061.81.80.22.072.02.002.0a)酶活力測(cè)定：i.首先制備待測(cè)粗酶液：取培養(yǎng)好菌株的分離培養(yǎng)基進(jìn)行4000rpm離心20min，并收集上清液即為待測(cè)粗酶液。ii.取20ml預(yù)先潔凈滅菌干燥的具塞刻度試管，編號(hào)。并按步驟操作：取粗酶液1.0ml→加2%的可溶性淀粉1ml，蒸餾水3ml，于60℃水浴中預(yù)熱5m