豬偽狂犬病的pcr診斷

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1、實驗七豬偽狂犬病PCR診斷實驗?zāi)康模?、了解PCR反應(yīng)的原理、方法及操作步驟；2、掌握豬偽狂犬病毒PCR檢測的方法；實驗內(nèi)容：1、講述PCR反應(yīng)的原理、方法及操作步驟，2、豬偽狂犬病毒PCR檢測。什么是PCR？聚合酶鏈式反應(yīng)（PolymeraseChainReaction，簡稱PCR）又稱無細胞分子克隆或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴增技術(shù)。一、PCR反應(yīng)的原理、方法及操作步驟PCR原理PCR是一種選擇性擴增DNA或RNA的方法，其基本原理是依據(jù)體內(nèi)細胞分裂中的DNA半保留復(fù)制機理，以及在體外DNA分子于不同溫度下雙鏈

2、和單鏈可以互相轉(zhuǎn)變的性質(zhì)，人為地控制體外合成系統(tǒng)的溫度，以促使雙鏈DNA變成單鏈；單鏈DNA與人工合成的引物退火，以及在dNTP存在下，耐高溫的DNA聚合酶使引物沿單鏈模板延伸成為雙鏈DNA。高溫變性，低溫退火，適溫延伸等３步反應(yīng)循環(huán)進行，使目的DNA得以迅速擴增。PCR原理PCR技術(shù)在模板DNA、dNTP、Mg2+、合適Buffer等條件下，用耐熱的Taq聚合酶代替DNA聚合酶，用合成的DNA引物代替RNA引物，經(jīng)過DNA變性、引物與模板結(jié)合（復(fù)性）和延伸3個步驟的反復(fù)循環(huán)（25?30次）過程，使目的DNA呈指數(shù)擴增。反

3、應(yīng)程序變性：93-94℃2min變性：93-94℃30s復(fù)性：55-65℃30s延伸：72℃30s延伸：72℃2min35個循環(huán)PCR原理SampledenaturatationPrimerannealingPrimerextensionPCRproduct標準的PCR反應(yīng)體系10×擴增緩沖液10ul4種dNTP混合物各200umol/L引物10～100pmol模板DNA0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L加雙或三蒸水至100ul酶及其濃度目前有兩種TaqDNA聚合酶供應(yīng)天然酶：從棲熱水

4、生桿菌中提純基因工程酶：大腸菌合成一個典型的PCR反應(yīng)約需酶量2.5U（指總反應(yīng)體積為100ul時）濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少引物引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計互補的寡核苷酸鏈做引物，用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增引物在線設(shè)計網(wǎng)址：http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgiPCR產(chǎn)物分析凝膠電泳分析法可用瓊脂糖（Ag

5、rose）或聚丙烯酰胺（PAGE）凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物的大小。同時應(yīng)以標準DNA分子量作平行對照，凝膠中加入溴化乙錠，電泳后，紫外檢測儀下觀察結(jié)果并拍照。二豬偽狂犬病毒感染PCR檢測-試劑盒使用方法注意事項：作業(yè)1、敘述PCR反應(yīng)的原理、操作方法及注意事項。2、敘述豬偽狂犬病毒感染PCR檢測的方法及結(jié)果判定。