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《膜翅目昆蟲干標(biāo)本的基因組DNA提取》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。
1、第27卷第4期動(dòng)物分類學(xué)報(bào)Vol.27,No.42002年10月ACTAZOOTAXONOMICASINICAOct.,20023膜翅目昆蟲干標(biāo)本的基因組DNA提取樸美花陳學(xué)新何俊華(浙江大學(xué)應(yīng)用昆蟲學(xué)研究所杭州310029)摘要提出了膜翅目昆蟲干標(biāo)本基因組DNA的提取方法,通過對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和所測(cè)得的基因片段(28SD2rDNA)的分析,表明該方法可行。關(guān)鍵詞基因組DNA,膜翅目,干標(biāo)本,提取.中圖分類號(hào)Q966近年來,昆蟲分子系統(tǒng)學(xué)和進(jìn)化研究迅猛發(fā)展,對(duì)昆蟲分子系統(tǒng)發(fā)育中常利用的分子標(biāo)記如mtDNA和rDNA的測(cè)序要求快速有效,因此昆蟲中有效基因組DNA的提取是重要
2、的前提。許多研究者介紹的基因組DNA的提取方法中所采用的材料基本上是新鮮樣品或超低溫冷凍標(biāo)本(Blin&Stafford,1976;Bowtell,1987;Gross2Bellarddetal.,1972;Kupiecetal.,1987;王文和施立明,1993),但是分子系統(tǒng)發(fā)育和進(jìn)化研究中經(jīng)常出現(xiàn)所研究的類群,特別是稀有類群難以得到新鮮材料的問題,因此往往需要利用自然博物館或標(biāo)本館的干標(biāo)本提取基因組DNA,但干標(biāo)本保存時(shí)間越長(zhǎng)基因組DNA的降解也越嚴(yán)重。因此,如何從干標(biāo)本中提取基因組DNA的方法對(duì)系統(tǒng)發(fā)育和進(jìn)化研究至關(guān)重要。本文結(jié)合膜翅目寄生性種類分子系統(tǒng)發(fā)育
3、研究,對(duì)干標(biāo)本中的基因組DNA的提取方法進(jìn)行了探索。1材料和方法1.1材料浙江大學(xué)應(yīng)用昆蟲學(xué)研究所標(biāo)本館里保存的分別采于1987年(山東濟(jì)南,2頭)、1980年(浙江奉化,2頭)、1954年(湖南東安,2頭)及1935年(江蘇宜興,2頭)的松毛蟲脊繭蜂AleiodesesenbeckiHartig(膜翅目:繭蜂科:內(nèi)繭蜂亞科)干標(biāo)本。每次DNA提取使用較完整的1頭松毛蟲內(nèi)繭蜂胸腹部及足,重復(fù)進(jìn)行2次。本實(shí)驗(yàn)所采用的松毛蟲脊繭蜂標(biāo)本,采集時(shí)用KCN毒死,陰干后制標(biāo)本,一直保存在密封、控制濕度的標(biāo)本館里,因此采集及保存條件幾乎完全一致。112設(shè)備PCR儀(TECHNEF
4、PROG05D),電泳儀(大連JM2250),臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(SIGMAD237520),恒溫金屬浴(大和CHB2100),微波爐(GALANZ),勻漿器,紫外透射儀(TANONUV2000),數(shù)碼相機(jī)及其附件(KODAKDC120),紫外分光光度儀(PERKINELMERMBA2000)。113基因組DNA提取3國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號(hào)39970099).收稿日期:2002O04O02,修訂日期:2002O04O20.6724期樸美花等:膜翅目昆蟲干標(biāo)本的基因組DNA提取673常規(guī)DNA提取方法(Gross2Bellard等,1972)通常是:取蟲體→碾
5、碎→在37℃下用ProK培育1h→乙酸鈉/ETOH沉淀→溶于50mlMilliQ·H2O→-20℃保存。實(shí)踐表明:常規(guī)方法只適用于從新鮮標(biāo)本中提取基因組DNA,而對(duì)干標(biāo)本卻不能獲得成功。為了從干標(biāo)本中提取基因組DNA,筆者摸索了一套新方法,即在利用常規(guī)方法之前,進(jìn)行比較關(guān)鍵性的處理。具體步驟如下:(1)在STE緩沖液(011mol/LNaCl,10mmol/LTris·ClpH810,1mmol/LEDTApH810)中浸漬5h[參考了Lambkin方法,在STE緩沖液中浸漬5h,碾碎組織,加入500μlTEbuffer(含有10%Chelexresin)和10μl
6、ProK(10mg/L),再次碾碎,53℃加熱5h,93℃再次加熱30min,冷藏備用。Dr.C.Lambkin,澳大利亞昆士蘭大學(xué)動(dòng)物與昆蟲學(xué)系,通訊聯(lián)系];(2)用沖洗緩沖液(10mmol/LTris·ClpH810,100mmol/LNaCl,1mmol/LMgCl2)沖洗2～3次;(3)將蟲體(1頭昆蟲的胸腹部及足)磨成粉末;(4)加入分離緩沖液(10mmol/LTris·ClpH8.0,10mmol/LEDTA,1%SDS);(5)再加入蛋白酶K,37℃水中1h;(6)加入5mol/LNaCl混勻,5000g離心數(shù)秒;(7)等體積酚∶氯仿∶異戊醇(25∶2
7、4∶1)反復(fù)抽提直到在界面上看不到蛋白質(zhì);(8)加入1/10體積3mol/LNaAc(pH512),再加入2倍體積的冰冷的100%乙醇,-20℃冰箱中放置015～110h;(9)50μlMilliQ·H2O溶解DNA。114PCR反應(yīng)反應(yīng)體系為:50μl體積,包括500ng以上的模板DNA,015μl215UTaq酶(Promega),5μl10×buffer,4μl25mmol/LMgCl2,1μl20μmol/LPrimers,5μl2mmol/LdNTPs(Promega)。引物:引用Dowton&Austin(1998)所采用的引物:擴(kuò)增28SD2rDN
