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1、tong.dxy.cn6蛋白質(zhì)水平檢測(cè)基因沉默6.1Westernblot6.1.1Westernblot的介紹1）原理WesternBlot印跡法是把通過電泳分離的蛋白質(zhì)組分從凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相支持物，通過抗體與附著于固相支持物的靶蛋白的抗原表位發(fā)生特異性反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)。WesternBlot既可以定性，又可以半定量，是初步鑒定靶蛋白表達(dá)的最方便也是最通用的方法。2）特點(diǎn)●分辨率高，采用SDS-PAGE變性電泳●靈敏度高，可檢測(cè)到pg級(jí)●準(zhǔn)確性高，通過與內(nèi)參蛋白比較對(duì)靶蛋白進(jìn)行相對(duì)含量3）實(shí)驗(yàn)流程（本公司采用濕轉(zhuǎn)法）34tong.dxy.cn6.1.2試劑耗材的準(zhǔn)備：1）轉(zhuǎn)膜緩
2、沖液（48mMTris-HCl，39mM甘氨酸，0.037％SDS，20％甲醇）：甘氨酸2.9gTris-HCl5.8gSDS0.37g甲醇200mL純水至1000mL溶解后室溫保存，溶液可重復(fù)使用3-5次2）10×麗春紅染液：麗春紅S2.0g三氯乙酸30.0g磺基水楊酸3.0g純水至100mL使用時(shí)將其稀釋10倍。3）TBS緩沖液：1mol/LTris-HCl(pH7.5)10.0mLNaCl8.8g純水至1000mL4）TBST緩沖液（含20％Tween20的TBS緩沖液）：20％Tween201.65mLTBS700mL混勻后即可使用，最好現(xiàn)用現(xiàn)配。5）封閉液（含5％脫脂
3、奶粉的TBST緩沖液）：脫脂奶粉5.0gTBST100mL最好現(xiàn)用現(xiàn)配，用量以蓋過膜面即可，一次性使用6）一抗、二抗及抗體稀釋液：參照說明書，以封閉液或TBST進(jìn)行稀釋。7）底物顯色液oECL，4C避光保存，現(xiàn)用現(xiàn)配。8）顯影液和定影液用水稀釋10-20倍于鋁盒中，可多次使用。室溫避光存放。35tong.dxy.cn6.1.3實(shí)驗(yàn)步驟:1）蛋白樣品制備：用細(xì)胞裂解液抽提蛋白，并測(cè)蛋白濃度。2）取1mg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE。oo3）轉(zhuǎn)膜：（轉(zhuǎn)膜緩沖液4C預(yù)冷備用，冷卻裝置于-80C冰箱冷凍備用）。4）將2張海綿墊、2張濾紙、轉(zhuǎn)膜夾子及玻棒浸泡在盛轉(zhuǎn)膜緩沖液的鋁盒中。5）戴上手
4、套，剪一張與凝膠尺寸相近的PVDF膜（83mm×75mm），左上角剪一缺口作為標(biāo)記，浸泡在盛有20mL甲醇的平皿中約15sec，直到膜變半透明。用純水沖洗膜2次。浸泡在盛轉(zhuǎn)膜緩沖液的鋁盒中。6）SDS-PAGE結(jié)束后，小心地剝下兩塊凝膠，一塊用于考馬斯亮蘭染色觀察電泳情況，另一塊浸泡在轉(zhuǎn)膜緩沖液中預(yù)平衡。海綿墊、濾紙、PVDF膜及凝膠的預(yù)平衡時(shí)間在15min-1hr之間。7）將轉(zhuǎn)膜夾子打開，使黑的一面保持水平。按照海綿墊、濾紙、凝膠、膜、濾紙和海綿墊的先后順序鋪墊，制備凝膠轉(zhuǎn)移夾層。將膜與凝膠對(duì)齊。用玻璃棒趕走氣泡。8）將夾子夾起來，扣緊，小心不要移動(dòng)內(nèi)層。放入電轉(zhuǎn)槽中。使夾子
5、的黑面對(duì)槽的黑面，夾子的白面對(duì)槽的紅面。9）將電轉(zhuǎn)槽放在冰水盒中。將預(yù)凍的冷卻裝置放入槽內(nèi)。緩慢倒入約650mL轉(zhuǎn)膜緩沖液。10）蓋好蓋子，接上電源。根據(jù)蛋白分子量來調(diào)節(jié)工作電流，一般使用100V（350mA），轉(zhuǎn)移60-90min。11）轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，斷開電源，拆卸轉(zhuǎn)膜夾子，逐一掀去各層。將膜用1×麗春紅染色5min，用水沖洗3次，觀察蛋白轉(zhuǎn)印是否完全。同時(shí)也可將凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色，膠上無藍(lán)色條帶則說明蛋白轉(zhuǎn)印完全。12）免疫反應(yīng)：I封閉：用鑷子將膜移至含有25mL封閉液的平皿中，用脫色搖床室溫緩慢o搖勻2hrs，或4C過夜。封閉完用TBST沖洗5sec。用吸水紙吸去殘余液。
6、II一抗孵育：按照一抗說明書的推薦比例稀釋一抗，使用TBST或封閉液稀o釋。在一容器中，將PVDF膜浸沒在抗體溶液里，室溫下2hrs或4C過夜，搖床緩慢搖勻。III一抗孵育完后，用TBST室溫下在搖床上洗3次，每次10min。IV二抗孵育：同上方法準(zhǔn)備二抗稀釋液并與膜接觸，室溫下?lián)u床緩慢搖勻1-2hrs。V二抗孵育完后，用TBST室溫下在搖床上洗3次，每次10min。13）顯影和定影：I將ECLPlus顯色液的A液和B液在容器里體積混合，根據(jù)膜的大小來確定顯色液的量，1min后，將膜與顯色液充分接觸。II反應(yīng)1-5min后，吸去膜上殘余液，將膜轉(zhuǎn)移至一干凈保鮮膜上，包好，放入壓
7、片夾中。III剪一張比膜尺寸稍大的X光片，打開壓片夾，將X光片放在膜上，一旦放上，便不能移動(dòng)。關(guān)上壓片夾，開始計(jì)時(shí)。IV根據(jù)信號(hào)強(qiáng)弱調(diào)整曝光時(shí)間，一般1-5min，也可選擇不同時(shí)間多次壓片以達(dá)最佳效果。V曝光結(jié)束后，打開壓片夾，將X光片迅速浸入備好的顯影液中顯影，待出36tong.dxy.cno現(xiàn)明顯條帶后，終止顯影。一般1-2min（20-25C）。VI顯影結(jié)束后，用水沖洗X光片，放到定影液中，定影時(shí)間一般為5-10min，以膠片透明為止。VII用水沖洗去底片上殘留的定影液，室溫下晾干。3
