RT-PCR引物設計原則和方法

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1、RT-PCR引物設計原則和方法近剛開始做PCR，參考了很多與引物設計相關的帖子，結(jié)合自己使用primer5和oligo的體會，想談談自己設計引物的方法和步驟，懇請各位前輩指正。RT-PCR引物設計原則和方法在NCBI上搜索到該基因，找到該基因的mRNA，在CDS選項中，找到編碼區(qū)所在位置，在下面的origin中，Copy該編碼序列作為軟件查詢序列的候選對象。打開PrimerPremier5，點擊File-New-DNAsequence,出現(xiàn)輸入序列窗口，Copy目的序列在輸入框內(nèi)（選擇As），此窗口內(nèi)，序列也可以直接翻譯成蛋白。點擊Primer，進入引物窗口。此窗口可以鏈接到“

2、引物搜索”、“引物編輯”以及“搜索結(jié)果”選項，點擊Search按鈕，進入引物搜索框，選擇“PCRprimers”，“Pairs”，設定搜索區(qū)域和引物長度和產(chǎn)物長度。在SearchParameters里面，可以設定相應參數(shù)。一般若無特殊需要，參數(shù)選擇默認即可，但產(chǎn)物長度可以適當變化，因為100～200bp的產(chǎn)物電泳跑得較散，所以可以選擇300～500bp。點擊OK，軟件即開始自動搜索引物，搜索完成后，會自動跳出結(jié)果窗口，搜索結(jié)果默認按照評分（Rating）排序，點擊其中任一個搜索結(jié)果，可以在“引物窗口”中，顯示出該引物的綜合情況，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各種信息

3、等。對于引物的序列，可以簡單查看一下，避免出現(xiàn)下列情況：3’端不要以A結(jié)尾，最好是G或者C，T也可以；3’不要出現(xiàn)連續(xù)的3個堿基相連的情況，比如GGG或CCC，否則容易引起錯配。此窗口中需要著重查看的包括：Tm應該在55～70度之間，GC％應該在45％～55％間，上游引物和下游引物的Tm值最好不要相差太多，大概在2度以下較好。該窗口的最下面列出了兩條引物的二級結(jié)構(gòu)信息，包括，發(fā)卡，二聚體，引物間交叉二聚體和錯誤引發(fā)位置。若按鈕顯示為紅色，表示存在該二級結(jié)構(gòu)，點擊該紅色按鈕，即可看到相應二級結(jié)構(gòu)位置圖示。最理想的引物，應該都不存在這些二級結(jié)構(gòu)，即這幾個按鈕都顯示為“None”為好

4、。但有時很難找到各個條件都滿足的引物，所以要求可以適當放寬，比如引物存在錯配的話，可以就具體情況考察該錯配的效率如何，是否會明顯影響產(chǎn)物。對于引物具體詳細的評價需要借助于Oligo來完成，Oligo自身雖然帶有引物搜索功能，但其搜索出的引物質(zhì)量感覺不如Primer5。在Primer5窗口中，若覺得某一對引物合適，可以在搜索結(jié)果窗口中，點擊該引物，然后在菜單欄，選擇File-Print-Currentpair，使用PDF虛擬打印機，即可轉(zhuǎn)換為Pdf文檔，里面有該引物的詳細信息。在Oligo軟件界面，F(xiàn)ile菜單下，選擇Open，定位到目的cDNA序列（在primer中，該序列已經(jīng)

5、被保存為Seq文件），會跳出來兩個窗口，分別為InternalStability（DeltaG）窗口和Tm窗口。在Tm窗口中，點擊最左下角的按鈕，會出來引物定位對話框，輸入候選的上游引物序列位置（Primer5已經(jīng)給出）即可，而引物長度可以通過點擊Change－Currentoligolength來改變。定位后，點擊Tm窗口的Upper按鈕，確定上游引物，同樣方法定位下游引物位置，點擊Lower按鈕，確定下游引物。引物確定后，即可以充分利用Analyze菜單中各種強大的引物分析功能了。Analyze中，第一項為Keyinfo，點擊Selectedprimers，會給出兩條引物的

6、概括性信息，其中包括引物的Tm值，此值Oligo是采用nearestneighbormethod計算，會比Primer5中引物的Tm值略高，此窗口中還給出引物的DeltaG和3’端的DeltaG。3’端的DeltaG過高，會在錯配位點形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引起DNA聚合反應，因此此項絕對值應該小一些，最好不要超過9。Analyze中第二項為DuplexFormation，即二聚體形成分析，可以選擇上游引物或下游引物，分析上游引物間二聚體形成情況和下游引物間的二聚體情況，還可以選擇Upper/Lower，即上下游引物之間的二聚體形成情況。引物二聚體是影響PCR反應異常的重要因素，因此應該

7、避免設計的引物存在二聚體，至少也要使設計的引物形成的二聚體是不穩(wěn)定的，即其DeltaG值應該偏低，一般不要使其超過4.5kcal/mol，結(jié)合堿基對不要超過3個。Oligo此項的分析窗口中分別給出了3’端和整個引物的二聚體圖示和DeltaG值。Analyze中第三項為HairpinFormation，即發(fā)夾結(jié)構(gòu)分析?？梢赃x擇上游或者下游引物，同樣，DeltaG值不要超過4.5kcal/mol，堿基對不要超過3個。Analyze中第四項為CompositionandTm，會給出上游引物、下游引