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1、中國神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志2004年1月第11卷第1期ChinJNeuroimmunol&Neurol2004,Vol.11,No.1·53·細(xì)胞凋亡的檢測方法(綜述)矯毓娟,劉江紅綜述許賢豪審校(衛(wèi)生部北京醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,北京100730)摘要:近年來,細(xì)胞凋亡一直是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域各專業(yè)的研究熱點(diǎn),凋亡檢測技術(shù)種類繁多卻并不完善,此文就凋亡的特征以及常用的細(xì)胞凋亡的各種定性、定量檢測方法的優(yōu)缺點(diǎn)做一綜述,同時(shí)提及了重要的凋亡調(diào)控基因和凋亡相關(guān)因子的檢測。關(guān)鍵詞:凋亡;檢測方法;調(diào)控基因;凋亡相關(guān)因子中圖分類號:Q255文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號:100622963(200
2、4)0120053204細(xì)胞凋亡(apoptosis)是由基因控制的細(xì)胞自細(xì)胞的胞膜完整性受到破壞,細(xì)胞不需固定即可被主的有序性死亡,又稱為程序性細(xì)胞死亡(pro2PI染色。凋亡細(xì)胞的胞膜成分亦發(fā)生改變,在凋亡grammedcelldeath),是真核細(xì)胞的一種特殊的死早期,原來位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸(PS)[4]亡形式。細(xì)胞凋亡與胚胎發(fā)育、自身免疫耐受、腫瘤遷移至脂雙層外側(cè)。另外,細(xì)胞凋亡時(shí)核酸內(nèi)切發(fā)生、病毒感染等生理、病理過程密切相關(guān),近年來酶被激活,首先將DNA切成50～300kb大小的一直是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域各專業(yè)的研究熱點(diǎn)。所以,在DNA,然后進(jìn)一步將染色質(zhì)
3、裂解成單個(gè)核小體和研究中如何選擇凋亡檢測方法很為關(guān)鍵。此文就凋寡聚核小體,形成180～200bp的DNA片斷。而壞亡的特征及常用的細(xì)胞凋亡的各種定性、定量檢測死細(xì)胞DNA斷裂無規(guī)律性。方法做一綜述。2細(xì)胞凋亡的檢測方法1細(xì)胞凋亡的特征211電鏡形態(tài)學(xué)觀察雖然光學(xué)顯微鏡下可以看見[1][5]111形態(tài)學(xué)改變1972年Kerr等就是根據(jù)形胞膜起泡現(xiàn)象和凋亡小體,但凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變態(tài)學(xué)的變化將凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞區(qū)分開來。細(xì)胞化大多發(fā)生在超微結(jié)構(gòu),因此用光鏡觀察難以令人滿凋亡的早期形態(tài)學(xué)改變是核染色質(zhì)濃聚、固縮,聚意,而透射電鏡可清楚地觀察到細(xì)胞結(jié)構(gòu)在凋亡不同集在核膜周邊,
4、然后是胞漿濃縮、胞膜起泡,繼而細(xì)時(shí)期的變化。電鏡形態(tài)學(xué)觀察是迄今為止判斷凋亡最胞核裂解成若干碎片,細(xì)胞膜將胞質(zhì)和染色質(zhì)斷片經(jīng)典、最可靠的方法,被認(rèn)為是確定細(xì)胞凋亡的金標(biāo)包裹,胞漿內(nèi)形成多個(gè)膜結(jié)構(gòu)尚完整的“小泡”及準(zhǔn)。缺點(diǎn):(1)只能定性,不能定量;(2)標(biāo)本處理過[2]“凋亡小體”(apoptoticbody)。這不同于細(xì)胞壞程復(fù)雜,設(shè)備相對昂貴,對檢查者的技術(shù)水平要求較死的細(xì)胞腫脹、胞膜破裂、細(xì)胞崩解。高,不適于大批標(biāo)本檢測;(3)在組織切片上進(jìn)行電112生化改變早期凋亡細(xì)胞及活細(xì)胞的胞膜正鏡觀察時(shí),有時(shí)凋亡很難與正常細(xì)胞有絲分裂相鑒[3][6]常,DNA染料碘化丙
5、錠(PI)拒染,但可被另外別,因?yàn)閮煞N情況下都可出現(xiàn)染色質(zhì)濃聚。如同時(shí)[7]一種DNA染料Hoechst342(Ho342)染色;而壞死進(jìn)行熒光染色,可彌補(bǔ)電鏡檢查的不足。收稿日期:2002211215;修訂日期:2002212204基金項(xiàng)目:北京市“十五”攻關(guān)課題資助項(xiàng)目(H01021055011)作者簡介:矯毓娟(19712),女,黑龍江人,在讀博士生,主治醫(yī)師。通訊地址:衛(wèi)生部北京醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,北京100730。聯(lián)系電話:(010)65212012。許賢豪(19372),男,上海市人,教授,博士生導(dǎo)師。1980—1986年,先后于美國紐約市蒙塞奈醫(yī)院、重癥肌無力
6、中心和白塞斯達(dá)市美國國立衛(wèi)生研究院、神經(jīng)病學(xué)研究所神經(jīng)免疫研究科做訪問學(xué)者,主要從事神經(jīng)病學(xué)、神經(jīng)免疫學(xué)、老年病學(xué)研究。通訊地址:衛(wèi)生部北京醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,北京100730。聯(lián)系電話:(010)65212012。Fax:(010)65212386。(通訊作者)·54·中國神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志2004年1月第11卷第1期ChinJNeuroimmunol&Neurol2004,Vol.11,No.1212DNA凝膠電泳(DNAladder)凋亡過程中接到斷裂DNA的3′2OH端發(fā)生聚合反應(yīng),然后進(jìn)DNA裂解是標(biāo)志細(xì)胞最終走向死亡的不可逆的重行檢測。此法與流式細(xì)胞技術(shù)相
7、結(jié)合可定量凋亡細(xì)要過程,DNA凝膠電泳也曾被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡判胞的百分比;與免疫組化結(jié)合可進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析。[8]定的金標(biāo)準(zhǔn)之一。抽提細(xì)胞的DNA,確定樣品中細(xì)胞凋亡時(shí)DNA斷裂早于形態(tài)學(xué)改變及DNA含DNA的量和純度,然后在瓊脂糖凝膠上電泳。正常量減少,因此該方法較之前述各法具有更高的靈敏活細(xì)胞的DNA凝膠電泳為一條區(qū)帶;細(xì)胞凋亡性。另外,研究證明TUNEL的敏感性遠(yuǎn)高于時(shí),由于DNA被裂解成單個(gè)核小體和寡聚核小ISNT,尤其是對早期凋亡的檢出TUNEL更為適體,電泳時(shí)呈現(xiàn)特征性的“階梯狀”(ladder)條帶,用。這兩種方法還可以同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞表面標(biāo)志
