《DNA分子標(biāo)記》PPT課件

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1、DNA分子標(biāo)記1/50隨機(jī)擴(kuò)增RAPD,ISSR,單核苷酸突變檢驗(yàn)SNP限制性酶切RFLP,PCR-RFLP,TRFP2/50RAPDRAPDrandomamplifiedpolymorphicDNAWilliamsetal.1990原理：隨機(jī)擴(kuò)增引物：任意序列的10個(gè)堿基的寡核苷酸片段模板：未知序列的基因組DNA3/504/50RAPD實(shí)驗(yàn)流程DNA提取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)數(shù)據(jù)記錄5/50RAPD很難判斷帶的有無背景影響嚴(yán)重Ｑ：帶的亮度差異很大？凝膠分辨率？6/50RAPD7/50RAPD陰性對(duì)照出帶陽性對(duì)照where8/50RAPD反應(yīng)體系BufferMg2+dNTPDNA聚合酶引

2、物DNAH2OMg2+濃度較高核酸外切酶活性較低單引物，序列短純度，濃度純度9/50RAPD反應(yīng)條件94℃36℃72℃引物退火溫度太低循環(huán)次數(shù)10/50RAPD陰性對(duì)照陽性對(duì)照可重復(fù)性11/50RAPD數(shù)據(jù)記錄0–1矩陣顯性標(biāo)記有有有有無有１１１１０１12/50RAPD缺陷可重復(fù)性低顯性標(biāo)記13/50RAPDRAPDrandomamplifiedpolymorphicDNA10堿基Williamsetal.1990AP-PCRarbitraryprimerPCR20,30堿基Welshetal.1990DAFDNAamplificationfingerprinting5,8個(gè)堿基Ca

3、etano-Anollesetal.199114/50隨機(jī)擴(kuò)增RAPD,ISSR,單核苷酸突變檢驗(yàn)SNP限制性酶切RFLP,PCR-RFLP,TRFP15/50ISSRISSRinter-simplesequencerepeatZietkiewiczetal.1994原理：隨機(jī)擴(kuò)增引物：20bp左右5’-BDB(ACA)5-3’16/5017/50ISSR50mMofKCl,1.5mMofMgCl2,0.25mMofdNTPs,2%formamide,0.2μMofprimer,0.5mMofspermidine,0.8UofTaqDNApolymeraseenzyme(Banglo

4、reGenei,India)and20ngofDNAper25μlreactionInitialdenaturationfor5minat94°C,eachcyclecomprised1-mindenaturationat94°C,45sannealingat49°C,2-minextensionat72°Cwithafinalextensionfor5minat72°Cattheendof45cycles.Mostofthepatternswithextremelygoodpolymorphismandusefulinformationwereoftenaccompaniedwit

5、habackgroundsmear.Toreducethissmear,2%formamidewasusedinthereaction.Allthepatternsgeneratedwererepeatedatleastthreetimesinordertoobtainreproducibledata.Joshietal.2000TheorApplGenet100:131118/50ISSR19/50ISSR可重復(fù)性高于RAPD隨機(jī)擴(kuò)增顯性標(biāo)記20/50SNPSNPsinglenucleotidepolymorphisms5’–GGATCAGTACTGACTCAG–3’5’–GGAT

6、CAGTAATGACTCAG–3’21/50SNPSNP變異來源轉(zhuǎn)換transition一種嘧啶置換另一種嘧啶C?T一種嘌呤置換另一種嘌呤A?G顛換transversion嘌呤與嘧啶互換，C?A，A?T等缺失/插入22/50SNP的檢測(cè)方法23/50SNP檢測(cè)－SNaPshot24/50SNP檢測(cè)－SNaPshot單引物擴(kuò)增25/50多重PCR:multiplexprimersextensionarraysSNP檢測(cè)－SNaPshot26/50SNP檢測(cè)－突變錯(cuò)配擴(kuò)增檢驗(yàn)180bp210bp共顯性標(biāo)記27/50SNP優(yōu)點(diǎn)特異性的共顯性基因有功能意義缺點(diǎn)引物設(shè)計(jì)困難28/50顯性與共

7、顯性23411112101180bp210bpRAPD顯性1231AAABBBSNP共顯性29/50花柱卷曲性的適應(yīng)意義AAControlCutaaAAAAAa共顯性標(biāo)記的應(yīng)用30/50顯性標(biāo)記的應(yīng)用種群遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)2345611011121111031000131/50隨機(jī)擴(kuò)增與特異性擴(kuò)增可重復(fù)性——數(shù)據(jù)的可靠性有條帶無條帶特異性擴(kuò)增擴(kuò)增成功擴(kuò)增不成功非特異性擴(kuò)增擴(kuò)增成功？32/50隨機(jī)擴(kuò)增RAPD,ISSR,單核苷酸突變檢驗(yàn)SNP限制性酶切RF