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1、Hela細(xì)胞傳代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆談?dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本原理和方法。實(shí)驗(yàn)用具:離心管(2支),移液槍?zhuān)總€(gè)臺(tái)面一把),槍頭(每個(gè)臺(tái)面一盒),吸管(4根),培養(yǎng)皿(每組2個(gè))實(shí)驗(yàn)藥品:0.25%胰酶,D-Hanks,1640培養(yǎng)基培養(yǎng)板常用玻璃器皿清洗浸泡(自來(lái)水)、刷洗(洗衣粉)、酸泡(24小時(shí))、流水沖洗、蒸溜水浸泡和沖洗、50℃烘干清潔液的配制HeLa是HenriettaLacks的簡(jiǎn)稱(chēng),HenriettaLacks是一位患有子宮頸癌的美國(guó)婦女的名字,在她死后,該細(xì)胞走被廣泛散發(fā)到各研究機(jī)構(gòu),并無(wú)限次地繁殖分裂下去。細(xì)胞培養(yǎng)的甚本概念傳代細(xì)胞在培養(yǎng)器皿中生長(zhǎng)一定時(shí)間后,被分開(kāi)接種到新的
2、培養(yǎng)器皿中。原代培養(yǎng)取自體內(nèi)新鮮組織并置于體外條件下生長(zhǎng)的細(xì)胞在傳代之前稱(chēng)為原代培養(yǎng)。培養(yǎng)細(xì)胞的特性貼附生長(zhǎng):必須貼附于支持物表面才能生長(zhǎng)。見(jiàn)于各種實(shí)體瘤細(xì)胞。懸浮生長(zhǎng):于懸浮狀態(tài)下即可生長(zhǎng),不需要貼附于支持物表面。見(jiàn)于各種造血系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞。每代貼附生長(zhǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程游離期貼壁期潛伏期對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期停止期(平臺(tái)期)游離期細(xì)胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài).也稱(chēng)懸浮期。此時(shí)細(xì)胞質(zhì)回縮,胞體呈圓球形。10分鐘一4小時(shí)貼壁期細(xì)胞附著于底物上,游離期結(jié)束。細(xì)胞株平均在10分鐘一4小時(shí)貼壁。血清中有促使細(xì)胞貼壁的冷析球蛋白和纖粘素、膠原等糖蛋白(生長(zhǎng)基質(zhì)),這些帶正電荷的糖蛋白的促貼壁因子先吸附于底物上
3、,懸浮細(xì)胞再與吸附有促貼壁因子的附著。進(jìn)口塑料培養(yǎng)瓶涂有生長(zhǎng)基質(zhì)(化學(xué)合成的功能基團(tuán))潛伏期此時(shí)細(xì)胞有生長(zhǎng)話(huà)動(dòng),而無(wú)細(xì)胞分裂。細(xì)胞株潛伏期一般為6~24小時(shí)。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期:細(xì)胞數(shù)隨時(shí)間變化成倍增長(zhǎng),活力最佳,最適合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。停止期(平臺(tái)期)細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)瓶壁后,細(xì)胞雖有活力但不再分裂機(jī)制:接觸抑制、密度依賴(lài)性培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的條件1細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)需要2細(xì)胞的生存環(huán)境溫度:37℃O2CO2:5%CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO3-pH:7.2-7.4滲透壓3無(wú)污染4無(wú)毒CO2培養(yǎng)箱CO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37℃,5%CO2。使用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)注意的問(wèn)題:①用螺旋口瓶培養(yǎng)細(xì)胞時(shí),
4、需將瓶蓋微松,以保證通氣。②保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈。定期消毒(90℃,14h)。③箱內(nèi)滅菌蒸餾水3000毫升蒸餾水槽中以保持箱內(nèi)濕度,避兔培養(yǎng)液蒸發(fā)。細(xì)胞傳代方法根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)的恃點(diǎn),傳代方法有3種1懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代離心法傳代:離心(1000轉(zhuǎn)/分)去上清,沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。直接傳代法:懸浮細(xì)胞沉淀在瓶壁時(shí),將上清培養(yǎng)液去除l/2一2/3,用吸管直接吹打形成細(xì)胞懸液再傳代。2.懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞傳代(Hela細(xì)胞)此類(lèi)細(xì)胞部分呈現(xiàn)貼壁生長(zhǎng)現(xiàn)象,但貼壁不牢,可用直接吹打法使紉胞從瓶壁脫落下來(lái),進(jìn)行傳代。3.貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞傳代采用酶消化法傳代。常用的消化液有0.25%的胰蛋白酶液。2細(xì)胞培
5、養(yǎng)用液的配制D-Hanks原液試劑配方氯化鈉80.0g磷酸氫二鈉(NaHPO·2HO)0.6g氯化鉀4.0g磷酸二氫鉀0.6g三蒸水1000mlD-Hanks工作液試劑配方D-Hanks原液100ml三蒸水896ml0.5%酚紅液4mlD-Hanks工作液試劑配方D-Hanks原液100ml三蒸水896ml0.5%酚紅液4ml消化液:胰蛋白酶作用于與賴(lài)氨酸或精氨酸相連接的肽健,除去細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白,影響細(xì)胞骨架,從而使細(xì)胞分離。胰蛋白酶液濃度越高,作用越強(qiáng),但超過(guò)一定限度會(huì)損傷細(xì)胞。胰蛋白酶是一種黃白色粉末,用無(wú)Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液配制常用的胰蛋白酶液濃度是0.25
6、%。用濾器過(guò)濾除菌。胰蛋白酶液消化時(shí)間:2-10分鐘。用含血清培養(yǎng)液終止其對(duì)細(xì)胞的消化作用培養(yǎng)基培養(yǎng)基(培養(yǎng)液)是維持體外細(xì)胞生存和生長(zhǎng)的溶液,分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。天然培養(yǎng)基:天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液(如雞胚和牛胚浸液)。優(yōu)點(diǎn):營(yíng)養(yǎng)成分豐富,培養(yǎng)效果好缺點(diǎn):來(lái)源受限。成分復(fù)雜,影響對(duì)某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提取和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。易發(fā)生支原體污染合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基是根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類(lèi)和數(shù)量,用人工方法模擬合成的。目前已設(shè)計(jì)出許多種培養(yǎng)基,如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。合成培養(yǎng)基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無(wú)機(jī)鹽和其它一些輔助物質(zhì)。優(yōu)點(diǎn):
7、標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn),組分和含量相對(duì)固定。成本低缺點(diǎn):缺少某些成分,不能完全滿(mǎn)足體外細(xì)胞生長(zhǎng)需要。人工合成培養(yǎng)基只能維持細(xì)胞生存,要想使細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖,還需補(bǔ)充一定量的天然培養(yǎng)基(如血清)。血清中含有:①多種蛋白質(zhì)(白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等)②多種金屬離子③激素;④促貼附物質(zhì),如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等。⑤各種生長(zhǎng)因子⑥轉(zhuǎn)移蛋白⑦不明成分一般說(shuō)來(lái).含5%小牛血清的培養(yǎng)基對(duì)大多數(shù)細(xì)胞可以維持細(xì)胞不死.但支持細(xì)胞生長(zhǎng)一般需加10%血清.對(duì)于血清支持細(xì)因生