腫瘤細胞與分化、凋亡

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1、細胞凋亡的生物學意義胚胎發(fā)育和形態(tài)發(fā)生細胞穩(wěn)態(tài)和免疫機制衰老腫瘤發(fā)生及化學治療細胞凋亡和惡性腫瘤1Bcl－2和惡性腫瘤2P53和惡性腫瘤3Bcr-abl和惡性腫瘤4PML-RARα蛋白和惡性腫瘤細胞凋亡干預和腫瘤治療1野生型P53基因介導的腫瘤治療2Bcl－2基因介導的腫瘤治療3泛素－蛋白酶體降解途徑介導的腫瘤治療4三氧化二砷介導的血液系統(tǒng)惡性腫瘤治療5DADS誘導腫瘤細胞凋亡細胞凋亡的檢測方法1臺肦藍（trypanblue)染色法原理：trypanblue是一種細胞膜非通透性染料。壞死細胞因細胞膜受損而被臺肦藍著色染色。因此，該法能區(qū)分細胞的生存狀態(tài)，簡單、便捷、常規(guī)用于

2、細胞死亡的初步評價和細胞存活率評價。注意事項：該法不能區(qū)別繼發(fā)性壞死和真正意義上的壞死細胞；也容易低估細胞死亡程度。（因為早期凋亡細胞具有完整的細胞膜而被誤當作活細胞）2.丫啶橙染色（acridineorange,AO)和溴化乙啶(ethidiumbromide,EB)雙染法原理：AO和EB都是結(jié)合DNA的熒光染料，分別產(chǎn)生藍色和橙色熒光。其中，AO能透過完整的細胞膜，而EB則只能染色胞膜受損的細胞。因此，AO/EB雙染法能借助熒光顯微鏡或流式細胞儀區(qū)分活細胞或早期凋亡細胞和壞死或繼發(fā)性壞死細胞。注意事項：應(yīng)用單一形態(tài)學計數(shù)凋亡細胞數(shù)（凋亡指數(shù)，apoptosisinde

3、x)常受到主觀因素的干擾，其個體間甚至同一主體的重復性較差。熒光顯微鏡觀察圖9A未處理的HL-60細胞圖9BDADS處理的HL-60細胞吖啶橙×40吖啶橙×403電子顯微鏡觀察法電鏡下超微結(jié)構(gòu)觀察雖可顯示凋亡細胞的許多特點，如膜發(fā)泡和某些結(jié)構(gòu)如微纖毛的丟失、染色質(zhì)固縮和線粒體超濃縮等，但由于樣本制備復雜、耗時，該項技術(shù)主要用于獲取細胞凋亡的定性檢測。3透射電鏡觀察圖8A未處理的HL-60細胞圖8BDADS處理的HL-60細胞透射電鏡×6000透射電鏡×60004DNA斷片法或稱瓊脂糖凝膠電泳“梯形條帶”圖譜法原理：凋亡細胞的基因組DNA常首先被剪切為200-300kb和30

4、-50kb的片斷（“結(jié)構(gòu)域式”剪切），再進一步降解產(chǎn)生大小相當于核小體(160-200bp)的倍數(shù)的寡核小體片斷（“裂解”/“梯子式”剪切）。因此，在瓊脂糖凝膠電泳圖譜上凋亡細胞表現(xiàn)為特征性“梯子”樣外觀。注意事項：梯狀DNA(DNAladder)現(xiàn)象常被看作是細胞凋亡的重要生物化學標志。但是，日益增多的資料顯示并不是所有表現(xiàn)凋亡形態(tài)學特征的細胞都是呈現(xiàn)這種梯子樣外觀。因此，缺乏梯狀DNA并不能排除細胞凋亡的存在。據(jù)報道，某些細胞系如K562細胞凋亡常發(fā)生單鏈而不是雙鏈DNA降解，故不能形成“DNAladder”。另外，一般凋亡率要在15%以上才能呈現(xiàn)典型“DNAladde

5、r”。故有DNAladder可以肯定凋亡存在，沒有DNAladder不能排除凋亡的存在。圖5不同濃度DADS作用HL-60細胞24h后DNA梯狀條帶的形成圖660μmol·L-1DADS作用HL-60細胞不同時間后DNA梯狀條帶的形成５.TUNEL法（末端DNA轉(zhuǎn)移酶dUTP缺口末端標記法）原理：DNA聚合酶能夠填補雙鏈DNA中的單鏈缺失部分，應(yīng)用放射性同位素、生物素和熒光素等標記的三磷酸核苷酸形成新的DNA。TUNEL法是在含標記dUTP的反應(yīng)體系中，加以末端DNA轉(zhuǎn)移酶。故又稱為TdT(terminaldeoxy-transferase)法。該法是應(yīng)用無需模板的DNA聚

6、合酶，延伸核苷酸的堿基序列與DNA底物無關(guān)。注意事項：該法只能了解DNA是否斷裂和發(fā)生DNA斷裂的細胞數(shù)量，雖然在理論上對這種方法的特異性尚有爭議，但操作簡便，并且可大量應(yīng)用于回顧性研究，從而成為目前較為流行的細胞凋亡評價方法。TUNEL檢測結(jié)果圖10A未處理的HL-60細胞圖10BDADS處理的HL-60細胞TUNEL×20TUNEL×206PI染色流式細胞術(shù)測定凋亡率原理：實驗證明凋亡細胞在固定和清洗過程中降解的小分子量DNA外漏，導致細胞內(nèi)DNA含量減少。因此，應(yīng)用DNA特異熒光染料（如碘化丙啶，propidiumiodide,PI）染色后，在FCM進行的細胞周期分析

7、中，凋亡細胞常以亞二聚體形式出現(xiàn)。亞二倍體細胞群被稱為亞G1期（sub-G1)細胞。它的出現(xiàn)被認為是凋亡細胞的重要標志。注意事項：識別亞G1期細胞的同時，必須將它和細胞碎片區(qū)分開來，因為細胞碎片的DNA含量也明顯低于G1期細胞。2.3流式細胞儀檢測凋亡率control5mg·L-1DADS7.5mg·L-1DADS10mg·L-1DADS15mg·L-1DADS20mg·L-1DADS10mg·L-1DADS+PD10mg·L-1DADS+SB圖7PI/AnnexinV雙染色檢測DADS作用HL-60細胞12h后凋