二氧化氯在植物外植體表面消毒中的應(yīng)用研究

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1、環(huán)境友好型消毒劑二氧化氯在植物外植體消毒中的應(yīng)用研究段永波1,周瑩瑩1,李鳳蘭2,陳文良3,趙豐蘭1,盛瑋1,張愛民1,滕井通1,薛建平1,*（1.淮北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/資源植物生物學(xué)安徽省重點實驗室淮北235000；2.北京必潔仕環(huán)保新技術(shù)開發(fā)有限公司北京101102；3.北京市農(nóng)林科學(xué)院北京100097）*通訊作者。E-mail:xuejp@163.com摘要：外植體表面消毒是植物組織培養(yǎng)中試驗材料轉(zhuǎn)為無菌狀態(tài)的第一環(huán)節(jié)。目前常用的消毒劑氯化汞和次氯酸鈉均有一定弊端，因此探索新型的植物外植體消毒方法非常重要。本研究以二氧化氯消毒劑為研究對象，調(diào)查其在禾谷類作物水稻種子、草本植物雪

2、蓮果和木本植物石榴外植體消毒上的應(yīng)用潛力。結(jié)果表明，80.0—133.0mg/LClO2處理水稻種子消毒效果較好，出愈率超過90%且所誘導(dǎo)愈傷質(zhì)量較好；28.6—33.3mg/L二氧化氯處理雪蓮果嫩葉后，愈傷組織誘導(dǎo)率接近80%，與0.1%HgCl處理結(jié)果相近。石榴的消毒試驗中，25—400mg/L二氧化氯處理后嫩葉均脫色褐化死亡，而0.1%HgCl處理組材料生長良好，但二氧化氯低于80%時，部分石榴材料被污染。二氧化氯作為一種環(huán)境友好的新型消毒劑，具有替代0.1%HgCl在某些植物外植體消毒上應(yīng)用的潛力。關(guān)鍵詞：二氧化氯；組織培養(yǎng)；水稻；雪蓮果；石榴前言在植物組織培養(yǎng)過程中，外植體消毒

3、是材料從帶菌環(huán)境轉(zhuǎn)為無菌狀態(tài)的關(guān)鍵步驟。目前植物組培中最常用的消毒劑為氯化汞和次氯酸鈉。然而，汞為重金屬元素，對環(huán)境和人體都有極大的負(fù)面影響，同時國家嚴(yán)禁汞消毒廢液排入下水道，無害化處理操作繁瑣；次氯酸鈉消毒反應(yīng)后產(chǎn)生三氯甲烷等致癌物和氯代酚等毒性物質(zhì)（Gunten等，2001；劉勇建等，2004），同樣威脅著環(huán)境安全和人類健康。因此，探索安全、高效和環(huán)境友好的新型植物外植體表面消毒劑意義重大。二氧化氯為一種強氧化劑，最早由英國化學(xué)家HumphreyDavey通過氯酸鉀水溶液和鹽酸反應(yīng)生成，對微生物細(xì)胞壁有較強的吸附穿透能力，能有效氧化細(xì)胞內(nèi)含巰基的酶并抑制微生物蛋白合成來殺滅微生物（韋

4、明肯等，2012）。二氧化氯與有機物及無機物反應(yīng)時均具有很強的選擇性，不產(chǎn)生發(fā)散性有機鹵化物（TOX）和具致癌作用的三鹵甲烷（TMH）。因此，世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦二氧化氯為安全消毒物質(zhì)中的A1級產(chǎn)品（張含松，2003）。關(guān)于二氧化氯在作飲用水消毒（代園園等，2011）、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)（鄭宏海等，2000；王化鵬等，2003；高寶巖等，2008；張明月等，2012）、水產(chǎn)品加工（史建華等，2006）、果蔬保鮮（潘永貴，2003；張順和和張超，2006）及食品工業(yè)（蔡慧農(nóng)和湯鳳霞，2003）等領(lǐng)域應(yīng)用的研究較多。然而，目前二氧化氯應(yīng)用于植物組織培養(yǎng)中外植體消毒的報道不多。由于生長環(huán)境和材料本

5、身差異，各種植物表面攜帶菌類和內(nèi)生菌種類均不同，因此探索各自適合的消毒方法很有必要。本研究以二氧化氯消毒劑為研究對象，調(diào)查其在禾谷類作物水稻種子、草本植物雪蓮果和木本植物石榴外植體消毒上的應(yīng)用潛力，為探索新型植物組培消毒方法提供參考。1材料與方法1.1實驗材料禾本科植物水稻種子由本研究組種植并保存；草本植物雪蓮果幼莖嫩芽取自淮北師范大學(xué)南山博士工作站試驗地；木本植物石榴幼莖嫩芽采自淮北師范大學(xué)校園。二氧化氯消毒劑由北京必潔仕環(huán)保新技術(shù)開發(fā)有限公司提供。氯化汞為武漢福德化工有限公司產(chǎn)品。1.2實驗方法1.2.1二氧化氯消毒劑配制將1片A劑藥片溶于50ml無菌水，完全溶解后加入5mlB劑，立

6、即蓋好瓶蓋，5分鐘后再加無菌水至500ml，獲得二氧化氯消毒劑原液（400mg/L）。將原液進行系列倍數(shù)稀釋，配制不同濃度二氧化氯消毒劑（現(xiàn)配現(xiàn)用）。具體濃度如下：1倍（200.0mg/L）、3倍（133.0mg/L）、5倍（80.0mg/L）、7倍（57.1mg/L）、9倍（44.4mg/L）、10倍（40.0mg/L）、12倍（33.3mg/L）、14倍（28.6mg/L）、16倍（25.0mg/L）。1.2.2實驗材料的預(yù)處理挑取飽滿、無病斑、胚完整的水稻種子用于表面消毒實驗；雪蓮果和石榴嫩葉經(jīng)流水沖洗30min，無菌濾紙吸干表面水分后進行消毒實驗。1.2.2外植體消毒方法水稻種子

7、于所試各濃度的二氧化氯溶液浸泡25min（期間不時搖動），吸干表面水分后接種至愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基NB（Duan等,2012），各培養(yǎng)皿接種20粒種子。雪蓮果嫩葉經(jīng)預(yù)處理后置于各濃度的二氧化氯溶液浸泡25min（期間不時搖動），吸干表面水分后接種于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS+2,4—D2.0mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L，pH5.8）培養(yǎng)基，各培養(yǎng)瓶接種10個外植體。石榴嫩芽在經(jīng)預(yù)處理后置于各濃度的二氧化氯溶液浸泡25min（期間不時搖