小鼠腎臟細(xì)胞系的建立

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1、細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)題目：小鼠腎臟上皮細(xì)胞系的建立設(shè)計(jì)者：班級(jí)生物1101姓名馬聰沖學(xué)號(hào)20113087指導(dǎo)教師：陳曉明日期：2013年11月11日西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院目錄一、基本原理（一）基本概念二、準(zhǔn)備工作（一）實(shí)驗(yàn)所需試劑與材料（二）實(shí)驗(yàn)所需的器材與設(shè)備（三）基本用液的配置（四）器材清洗、干燥與消毒三、實(shí)驗(yàn)步驟（一）取材（二）原代培養(yǎng)（三）傳代培養(yǎng)（四）細(xì)胞純化（五）細(xì)胞系的建立（六）細(xì)胞冷凍保存（七）凍存細(xì)胞的復(fù)蘇四、注意事項(xiàng)小鼠腎臟上皮細(xì)胞系的建立一基本原理動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)（animalcellculture）就是從動(dòng)物機(jī)體中取出相關(guān)的組織，將它分散成單個(gè)細(xì)胞（

2、使用胰蛋白酶或膠原蛋白酶）然后，放在適宜的培養(yǎng)基中，讓這些細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖。這個(gè)實(shí)驗(yàn)方案就是選取小鼠腎臟上皮利用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)建立細(xì)胞系。二準(zhǔn)備工作1.實(shí)驗(yàn)所需的試劑與材料健康小鼠、火柴、酒精燈、青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶、EDTA、稀鹽酸、蒸餾水、20%新潔爾滅、70%乙醇、D-Hanks液、甲醛、高錳酸鉀、甘油、濾紙、0.22濾膜、臺(tái)盼藍(lán)、培養(yǎng)基成分（見(jiàn)表）2.實(shí)驗(yàn)所需器材與設(shè)備培養(yǎng)皿、鑷子、手術(shù)刀、手術(shù)剪刀、小燒杯、吸管、三角瓶、棉球、細(xì)胞計(jì)數(shù)板、濾器、毛刷、超凈工作臺(tái)、紫外燈、液氮、凍存管、溶液瓶、量筒、毛帕、臉盆、一次性手套3.基本用液的配置RPMI-1640培養(yǎng)基的制

3、備與消毒序號(hào)化合物名稱含量(mg/L)序號(hào)化合物名稱含量(mg/L)1L-精氨酸290.0021硝酸鈣100.002L-門(mén)冬酰胺50.0022無(wú)水硫酸鎂48.843L-門(mén)冬氨酸20.0023無(wú)水磷酸二氫鈉676.134L-胱氨酸二鹽酸鹽65.1524氯化鉀400.005L-谷氨酸20.0025氯化鈉6000.006甘氨酸10.0026葡萄糖2000.007L-組氨酸15.0027還原谷胱甘肽1.008L-羥脯氨酸20.0028酚紅5.009L-異亮氨酸50.0029L-谷氨酰胺300.0010L-亮氨酸50.0030生物素0.2011L-賴氨酸鹽酸鹽40.0031D-泛酸鈣0.

4、2512L-甲硫氨酸15.0032葉酸1.0013L-苯丙氨酸15.0033i-肌醇35.0014L-脯氨酸20.0034煙酰胺1.0015L-絲氨酸30.0035氯化膽堿3.0016L-蘇氨酸20.0036鹽酸吡哆醇1.0017L-色氨酸5.0037核黃素0.2018L-酪氨酸23.1938鹽酸硫胺素1.0019L-纈氨酸20.0039維生素B120.00520對(duì)氨基苯甲酸1.00常用的培養(yǎng)基滅菌方法有化學(xué)滅菌、射線滅菌、干熱滅菌、濕熱滅菌、過(guò)濾滅菌。因?yàn)榛瘜W(xué)藥劑與培養(yǎng)基的一些成分作用，所以不采用；因?yàn)樽贤饩€的穿透能力弱，所以僅用于表面消毒和空氣的消毒。所以本次實(shí)驗(yàn)采用濕熱滅

5、菌D-Hanks液的配制：1）溶解定容：將藥品（NaCl：4.0g，KCl：0.2g，Na2HPO4·12H2O：0.06g，KH2PO4：0.3g，NaHCO3：0.15g）倒入盛有雙蒸水的燒杯中，玻璃棒攪動(dòng)，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中準(zhǔn)確定容至500ml，搖勻即成新配制的D-Hanks溶液。2）移入溶液瓶?jī)?nèi)待消毒：將D-Hanks倒入溶液瓶（大的吊針瓶）內(nèi)，蓋上膠帽，并插上針頭放入高壓鍋內(nèi)8磅消毒20分鐘。注意高壓消毒后要用滅菌蒸餾水補(bǔ)充蒸發(fā)掉的水份。0.02%EDTA溶液的配置：EDTA0.20g、Nacl8.00g、KCl0.20g、葡萄糖2.00g、0.5%酚紅

6、4ml，加入蒸餾水定容至1000ml。10磅20min高壓滅菌，使用時(shí)調(diào)節(jié)PH值到7.4。胰蛋白溶液:1）用少量的D-Hanks液把胰蛋白酶粉末調(diào)成糊狀2）補(bǔ)足D-Hanks液，震蕩搖勻，置4℃冰箱內(nèi)過(guò)夜3）次日，等胰蛋白酶溶解后用濾紙過(guò)濾4）濾紙?jiān)俳?jīng)過(guò)0.22濾膜除菌5）分裝小瓶放到冰箱內(nèi)低溫保存6）使用時(shí)，用NaHCO3調(diào)節(jié)至PH7.0左右0.4%臺(tái)盼藍(lán)母液：稱取4克臺(tái)盼藍(lán)，加入少量蒸餾水研磨，加雙蒸水至100ml，用濾紙過(guò)濾，4℃保存。4.器械清洗、干燥與消毒（1）常用的器械消毒方法大概分為兩類(lèi)，一類(lèi)是物理滅菌，主要包括濕熱滅菌、過(guò)濾滅菌、干熱滅菌和紫外線滅菌。還有化學(xué)方

7、法主要包括熏蒸消毒和藥劑噴霧消毒。這次試驗(yàn)，我采用以下消毒方式。1）高壓蒸汽滅菌：也稱濕熱滅菌，適用于對(duì)一般培養(yǎng)基、玻璃器皿、布類(lèi)、橡膠制品、金屬器械等的滅菌。高溫高壓蒸汽對(duì)生物材料有良好的穿透力，能造成蛋白質(zhì)變性凝固而使微生物死亡，是一種最有效的滅菌方法。一般在103-137kPa壓力下，15-30分鐘，所有微生物包括芽孢在內(nèi)都可被殺死。滅菌后需要及時(shí)烘干。2）紫外線滅菌：細(xì)菌吸收紫外線后，蛋白質(zhì)和核酸發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，引起細(xì)菌的染色體變異，造成死亡。紫外線波長(zhǎng)為200-300nm,其中，以2