CR技術(shù)及其發(fā)展和應(yīng)用

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1、PCR技術(shù)及其發(fā)展和應(yīng)用張雪梅檢驗系臨床生化教研室主要參考書CW迪芬巴赫、GS德弗克斯勒［美］主編?！禤CR技術(shù)實驗指南》黃留玉主編。《PCR最新技術(shù)原理、方法及應(yīng)用》尹一兵主編?！斗肿釉\斷學(xué)》目錄PCR技術(shù)的原理PCR技術(shù)的衍生技術(shù)實時熒光PCR技術(shù)PCR技術(shù)的應(yīng)用一、PCR的基本原理PCR反應(yīng)體系PCR過程PCR的特點標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系4種dNTP混合物各200umol/L引物　　　　　各10～100pmol模板DNA0.1～2ugDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/LPCR的基本原理PCR反

2、應(yīng)體系PCR過程PCR的特點1234522557294時間（min）溫度（℃）PCR的基本原理PCR反應(yīng)體系PCR過程PCR的特點適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍MOVIEPCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點1234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引

3、物復(fù)性子鏈延伸DNA加倍DNA變性形成2條單鏈模板DNA95℃PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點50℃引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點第1輪結(jié)束95℃第2輪開始PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點50℃TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點72℃第2輪結(jié)束PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR

4、的特點模板DNA第1輪擴(kuò)增第2輪擴(kuò)增第3輪擴(kuò)增第4輪擴(kuò)增第5輪擴(kuò)增第6輪擴(kuò)增理想拷貝數(shù)=2nn循環(huán)次數(shù)實際拷貝數(shù)=(1+x)nX平均效率,約為0.85n循環(huán)次數(shù)重復(fù)30輪后230=1,073,741,8241.8530=103,550,417PCR技術(shù)簡史核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明PCR的完善1971年，Khorana提出：經(jīng)過DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆tRNA基因。但由于測序和引物合成的困難，以及70年代基因工程技術(shù)的發(fā)明使克隆基因成為可能，所以

5、，Khorana的設(shè)想被人們遺忘了……PCR技術(shù)簡史核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明PCR的完善1985年，美國PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）基本原理是在試管中模擬細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制然而，采用E-coliDNA聚合酶進(jìn)行PCR，由于該酶不耐熱，使這一過程耗時，費力，且易出錯PCR技術(shù)簡史核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明PCR的完善1988年初，Keohanog改用T4DNA聚合酶進(jìn)行PCR，其擴(kuò)增的DNA片段很均一，真實性也較高，只有所期望的一種DNA片段。但每循

6、環(huán)一次，仍需加入新酶。1988年Saiki等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌(thermusaquaticus)中提取到一種耐熱DNA聚合酶。耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用使得PCR能高效率的進(jìn)行，隨后PE-Cetus公司推出了第一臺PCR自動化熱循環(huán)儀實驗步驟（1）在0.5mlPCR管內(nèi)配置20ul反應(yīng)體系：CK(ul)1#(ul)模板01引物10.50.5引物20.50.510×PCRBuffer22Taq酶0.20.2dNTPs0.50.5ddH2O16.315.3Total2020（2）PCR反應(yīng)程序(1)9

7、4℃變性5min，(2)94℃變性1min，(3)52℃退火1min，(4)72℃延伸1min。(5)72℃延伸10min。重復(fù)(2)-(4)30次PCR結(jié)果：1、對照(無模板)；2－6、PCR產(chǎn)物（5ul樣品）PCR產(chǎn)物的電泳鑒定PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點靈敏度高皮克(pg=10-12)量級擴(kuò)增到微克(ug=10-6)水平能從100萬個細(xì)胞中檢出一個靶細(xì)胞病毒檢測的靈敏度可達(dá)3個RFU細(xì)菌檢測的最小檢出率為3個細(xì)菌簡便、快速一次性加好反應(yīng)液，1～4小時完成擴(kuò)增擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分

8、析對標(biāo)本的純度要求低血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等組織的粗提DNA（1）模板單、雙鏈DNA均可，多種來源。質(zhì)量要求不高，但不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類。一般人基因組100ngDNA模板（100?L）。模板濃度過高會導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。PCR反應(yīng)的影響因素1)反應(yīng)體系Lambda?DNA，模板量分別為100?pg,?10pg,?1pg,?100fg?,?10fg（2）