《westernblot技術(shù)》PPT課件

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1、WesternBlot技術(shù)姓名：========印跡法◆Southern印跡法◆Northern印跡法◆Western印跡法◆Eastern印跡法印跡法（blotting）:將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的探測反應(yīng)來檢測樣品的一種方法。CompanyLogoWesternBlot原理在電場的作用下將電泳分離的多肽從凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相支持體，然后用這種多肽的特異抗體來檢測。CompanyLogoWesternBlot原理經(jīng)電泳分離后的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的

2、抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。CompanyLogoWesternBlot操作步驟一.制備、處理蛋白樣品◆通過有機(jī)溶劑或水溶法制備總蛋白通過層析或電洗脫法制備目的蛋白◆將待分離的蛋白樣品與樣品緩沖液按4:1比例混合(50～100μg蛋白),沸水煮沸10min,立即插入碎冰中備用。CompanyLogoWesternBlot操作步驟二.SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳◆制備聚丙烯酰胺凝膠：將玻璃板洗凈,水不掛壁為準(zhǔn),晾干,底邊和兩側(cè)對齊,兩側(cè)夾緊,立于制膠架上。根據(jù)所要分析的蛋白質(zhì)分子量大小配制分離膠,沿玻璃

3、板上的左上角位置連續(xù)平穩(wěn)注入兩層玻璃板中,待分離膠聚合、凝固后,將積層膠溶液也沿玻璃板左上角注入后立即插入梳子。CompanyLogoWesternBlot操作步驟二.SDS聚丙烯酰胺凝膠◆上樣：將制備好的凝膠(帶著梳子)小心從制膠架上取下,放置于電泳槽槽中,將電泳緩沖液注入電泳槽中,緩慢拔出梳子，吸取處理好的蛋白樣品20～30LL點(diǎn)樣。◆電泳：打開電源,選擇穩(wěn)壓模式電泳(也可選擇恒流電泳),80～200V工作電壓，積層膠用80-100V,分離膠用150-200V。待溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部時(約1h后)停止電泳。CompanyLogoWesternBlot操作步驟三.轉(zhuǎn)膜◆取膠：電泳結(jié)束后用

4、塑料板小心將膠從兩塊玻璃板之間剝離出來，用轉(zhuǎn)移緩沖液洗凈?！糁谱鬓D(zhuǎn)移三明治：打開轉(zhuǎn)移盒，三明治順序：正極面——海綿墊——3張Whatman濾紙——PVDF膜——凝膠——3張Whatman濾紙——海綿墊——負(fù)極面。關(guān)上轉(zhuǎn)移盒。CompanyLogoWesternBlot操作步驟三.轉(zhuǎn)膜◆轉(zhuǎn)移：將轉(zhuǎn)移盒放入轉(zhuǎn)移槽，正極面對紅板，負(fù)極面對黑板，加滿轉(zhuǎn)移緩沖液，通電轉(zhuǎn)移，將轉(zhuǎn)移槽放入4℃冰箱內(nèi)，200mA轉(zhuǎn)移2h。◆洗膜：打開三明治，取膜。將膜浸泡于TBST中，置于搖床上洗膜10min.CompanyLogoWesternBlot操作步驟四.封閉◆將轉(zhuǎn)移膜取下，用PBS漂洗,放入小塑料袋中,加入適

5、量新鮮封閉液,擠趕氣泡,用電熱封口機(jī)封口后室溫下放在搖床上搖。CompanyLogoWesternBlot操作步驟五.免疫反應(yīng)◆加一抗：將封閉過的膜取出,再放入一新塑料袋中,加入一抗液,擠趕氣泡,封口。室溫下在搖床上搖1h,或4℃冰箱放置過夜。◆洗膜：用TBST洗膜液洗去未結(jié)合靶蛋白的抗體。◆加二抗：將漂洗過的膜放入新塑料袋中,加入二抗液。室溫下在水平搖床上搖2h。CompanyLogoWesternBlot操作步驟六.底物顯色◆化學(xué)發(fā)光反應(yīng)(ECL)檢測◆放射自顯影◆底物熒光ECF◆底物DAB呈色CompanyLogoWesternBlot操作步驟六.底物顯色◆化學(xué)發(fā)光反應(yīng)(ECL)檢測

6、：取出洗過的濾膜,先在濾紙上瀝干。將膜放入小暗盒中,加發(fā)光液于膜上,室溫孵育3min,立即準(zhǔn)備壓片曝光。CompanyLogoWesternBlot操作步驟六.底物顯色◆曝光及沖洗X光膠片：在暗室中觀察發(fā)光條帶的強(qiáng)度,確定曝光時間。將X光膠片放在暗盒中的濾膜上,蓋嚴(yán),計(jì)時曝光,沖洗X光片?！舴治觯河媚z成像系統(tǒng)掃描圖像，檢測積分吸光度值,分析目標(biāo)帶的分子量和凈光密度值。CompanyLogoWesternBlot所用儀器CompanyLogoWesternBlot常見問題分析一.條帶比正常的窄？出現(xiàn)“微笑”或“倒微笑”條帶？◆凝膠聚合不均勻，灌膠時候盡量混合均勻，動作輕緩；◆拔梳子要迅速，

7、清洗加樣孔要小心，以免把上樣帶扭曲；◆樣品鹽濃度過高會擠壓其他條帶導(dǎo)致寬窄不一，純化樣品，調(diào)整鹽濃度；◆膠板底部有氣泡會影響電泳效果，應(yīng)趕走氣泡。同時注意電泳槽裝置是否合適。CompanyLogoWesternBlot常見問題分析二.凝膠腫脹或卷曲？條帶歪斜或漂移？單個或多個白點(diǎn)？轉(zhuǎn)膜緩沖液過熱？◆可將凝膠在轉(zhuǎn)膜之前放到轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡5-10min；◆電轉(zhuǎn)儀長期使用導(dǎo)致海綿變薄，“三明治”結(jié)構(gòu)不緊湊導(dǎo)致。可在兩塊海綿之