活體生物發(fā)光成像技術(shù)的最新進展

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1、活體生物發(fā)光成像技術(shù)的最新進展活體生物發(fā)光成像技術(shù)的最新進展活體動物體內(nèi)光學(xué)成像(OpticalinvivoImaging)主要采用生物發(fā)光（bioluminescence）與熒光（fluorescence）兩種技術(shù)。生物發(fā)光是用熒光素酶(Luciferase)基因標(biāo)記細(xì)胞或DNA，而熒光技術(shù)則采用熒光報告基團（GFP、RFP,Cyt及dyes等）進行標(biāo)記。利用一套非常靈敏的光學(xué)檢測儀器，讓研究人員能夠直接監(jiān)控活體生物體內(nèi)的細(xì)胞活動和基因行為。通過這個系統(tǒng)，可以觀測活體動物體內(nèi)腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移、感染性疾病發(fā)

2、展過程、特定基因的表達等生物學(xué)過程。傳統(tǒng)的動物實驗方法需要在不同的時間點宰殺實驗動物以獲得數(shù)據(jù),得到多個時間點的實驗結(jié)果。相比之下，可見光體內(nèi)成像通過對同一組實驗對象在不同時間點進行記錄，跟蹤同一觀察目標(biāo)（標(biāo)記細(xì)胞及基因）的移動及變化，所得的數(shù)據(jù)更加真實可信。另外,這一技術(shù)對腫瘤微小轉(zhuǎn)移灶的檢測靈敏度極高，不涉及放射性物質(zhì)和方法,非常安全。因其操作極其簡單、所得結(jié)果直觀、靈敏度高等特點,在剛剛發(fā)展起來的幾年時間內(nèi)，已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)研究及藥物開發(fā)等方面。<

3、!--AdforwardBegin:-->一、技術(shù)原理1.標(biāo)記原理　　哺乳動物生物發(fā)光，是將Fluc基因整合到細(xì)胞染色體DNA上以表達熒光素酶，當(dāng)外源（腹腔或靜脈注射）給予其底物熒光素(luciferin)，即可在幾分鐘內(nèi)產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象。這種酶在ATP及氧氣的存在條件下，催化熒光素的氧化反應(yīng)才可以發(fā)光，因此只有在活細(xì)胞內(nèi)才會產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象，并且光的強度與標(biāo)記細(xì)胞的數(shù)目線性相關(guān)。對于細(xì)菌，lux操縱子由編碼熒光素酶的基因和編碼熒光素酶底物合成酶的基因組成，帶有這種操縱子的細(xì)菌

4、會持續(xù)發(fā)光，不需要外源性底物?！　』?、細(xì)胞和活體動物都可被熒光素酶基因標(biāo)記。標(biāo)記細(xì)胞的方法基本上是通過分子生物學(xué)克隆技術(shù),將熒光素酶的基因插到預(yù)期觀察的細(xì)胞的染色體內(nèi)，通過單克隆細(xì)胞技術(shù)的篩選,培養(yǎng)出能穩(wěn)定表達熒光素酶的細(xì)胞株。目前,常用的細(xì)胞株基本上都已標(biāo)記好,市場上已有銷售。將標(biāo)記好的細(xì)胞注入小鼠體內(nèi)后,觀測前需要注射熒光素酶的底物—熒光素，為約280道爾頓的小分子。熒光素脂溶性非常好,很容易透過血腦屏障。注射一次熒光素能保持小鼠體內(nèi)熒光素酶標(biāo)記的細(xì)胞發(fā)光30-45分鐘。每次熒光素酶催化反應(yīng)只產(chǎn)生一個

5、光子，這是肉眼無法觀察到的，精諾真公司（XenogenCorp.）生產(chǎn)的IVIS成像系統(tǒng)，應(yīng)用一個高度靈敏的制冷CCD相機及特別設(shè)計的成像暗箱和成像軟件，可觀測并記錄到這些光子。2.光學(xué)原理　　光在哺乳動物組織內(nèi)傳播時會被散射和吸收，光子遇到細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)時會發(fā)生折射現(xiàn)象，而且不同類型的細(xì)胞和組織吸收光子的特性并不一樣。在偏紅光區(qū)域,大量的光可以穿過組織和皮膚而被檢測到。利用精諾真公司的IVIS系統(tǒng)最少可以看到皮下的500個細(xì)胞，當(dāng)然，由于發(fā)光源在老鼠體內(nèi)深度的不同可看到的最少細(xì)胞數(shù)是不同的。在相同的深度情

6、況下,檢測到的發(fā)光強度和細(xì)胞的數(shù)量具有非常好的線性關(guān)系?？梢姽怏w內(nèi)成像技術(shù)的基本原理在于光可以穿透實驗動物的組織并且可由儀器量化檢測到的光強度，同時反映出細(xì)胞的數(shù)量。3.實驗過程　　通過分子生物學(xué)克隆技術(shù),應(yīng)用單克隆細(xì)胞技術(shù)的篩選，將熒光素酶的基因穩(wěn)定整合到預(yù)期觀察的細(xì)胞的染色體內(nèi)，培養(yǎng)出能穩(wěn)定表達熒光素酶蛋白的細(xì)胞株。典型的成像過程是：小鼠經(jīng)過麻醉系統(tǒng)被麻醉后放入成像暗箱平臺，軟件控制平臺的升降到一個合適的視野，自動開啟照明燈拍攝第一次背景圖。下一步，自動關(guān)閉照明燈,在沒有外界光源的條件下拍攝由小鼠體內(nèi)發(fā)

7、出的光，即為生物發(fā)光成像。與第一次的背景圖疊加后可以清楚的顯示動物體內(nèi)光源的位置，完成成像操作。之后，軟件完成圖像分析過程。使用者可以方便的選取感興趣的區(qū)域進行測量和數(shù)據(jù)處理及保存工作。當(dāng)選定需要測量的區(qū)域后，軟件可以計算出此區(qū)域發(fā)出的光子數(shù)，獲得實驗數(shù)據(jù)。軟件的數(shù)據(jù)處理和保存功能非常強大，可以加快實驗速度，方便大批量的實驗。4．熒光成像功能　　精諾真活體動物成像系統(tǒng)IVIS200具有內(nèi)置熒光成像功能。熒光發(fā)光是通過激發(fā)光激發(fā)熒光基團到達高能量狀態(tài)，而后產(chǎn)生發(fā)射光。常用的有綠色熒光蛋白(GFP)、紅色熒光蛋

8、白DsRed及其它熒光報告基團，標(biāo)記方法與體外熒光成像相似。熒光成像具有費用低廉和操作簡單等優(yōu)點。同生物發(fā)光在動物體內(nèi)的穿透性相似，紅光的穿透性在體內(nèi)比藍綠光的穿透性要好得多，近紅外熒光為觀測生理指標(biāo)的最佳選擇。Xenogen的IVIS系統(tǒng)可檢測波長范圍400-950nm的熒光，通過六塊不同的激發(fā)光濾鏡獲得所需的特定激發(fā)光波長。光線通過第二塊藍色漂移背景光濾鏡（blue-shiftedbackgroundfilt