基因工程7-DNA序列分析

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1、第九章DNA序列分析DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解明之后，研究基因組中每一個(gè)基因的作用就成為了生物科學(xué)工作者的主要課題。為此，首先必須設(shè)法知道目的基因的核苷酸排列順序，即基因測序。DNA測序方法：Maxam-Gilbert化學(xué)降解法雙脫氧鏈終止法（Sanger酶學(xué)法）第一節(jié)Maxam-Gilbert化學(xué)降解法1977年，A.M.Maxam和W.Gilbert首先建立了DNA片段序列的測定方法，由于該方法是用特定化學(xué)試劑修飾不同堿基，并在相應(yīng)堿基處切斷DNA片段而進(jìn)行系列分析的，故稱之為Maxam-Gilbert化學(xué)降解法。一、基本原理將待測DNA片段的5’

2、端磷酸基團(tuán)作放射性標(biāo)記，再分別采用不同的化學(xué)方法對特定堿基進(jìn)行化學(xué)修飾并在該位置打斷核酸鏈，從而產(chǎn)生一系列5’端被標(biāo)記的長度不一且分別以不同堿基結(jié)尾的DNA片段，這些以特定堿基結(jié)尾的片段群通過并列點(diǎn)樣的方式用凝膠電泳進(jìn)行分離，再經(jīng)放射自顯影，即可讀出目的DNA的堿基序列。直接或間接特異性識別4種堿基生成其始于固定起點(diǎn)和終止于特定堿基的一組核苷酸片段特定化學(xué)試劑可對堿基進(jìn)行特異性修飾在修飾堿基處（5’或3’）打斷磷酸二酯鍵二、化學(xué)降解測序法的基本步驟對待測DNA片段的5’端磷酸基團(tuán)作放射性標(biāo)記；用化學(xué)修飾劑修飾特定堿基；凝膠電泳分離和放射自顯影及

3、讀序。第二節(jié)Sanger雙脫氧鏈終止法一、基本原理雙脫氧核苷酸（ddNTP）分子的脫氧核糖的3’位置的羥基缺失，當(dāng)它與正常核苷酸混合在同一個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)體系中時(shí)，在DNA聚合酶的作用下，雖然它也能參與DNA合成，但由于其3’位置的羥基缺失，使其下面的核苷酸的5’磷酸基無法與之結(jié)合。也就是說，一旦雙脫氧核苷酸整和到正在合成的DNA鏈中，該股DNA的合成就到此終止。以待測單鏈或雙鏈DNA為模板，使用能與DNA模板結(jié)合的一段寡核苷酸為引物，在DNA聚合酶的催化作用下合成新的DNA鏈。正常情況下的DNA聚合酶催化反應(yīng)在其反應(yīng)體系中包含4種脫氧核苷酸，合成與

4、模板DNA互補(bǔ)的新鏈。當(dāng)向該反應(yīng)體系中加入一種雙脫氧核苷酸后，在DNA合成過程中ddNTP將與相應(yīng)的dNTP競爭摻入到新合成的DNA互補(bǔ)鏈中。如果dNTP摻入其中，則DNA互補(bǔ)鏈將繼續(xù)延伸下去；而如果ddNTP摻入其中，DNA互補(bǔ)鏈則到此終止。二、序列分析的基本步驟1、模板制備和引物設(shè)計(jì)模板：單鏈或雙鏈DNA，必須保證足夠的濃度引物：18-22nt，55-60℃，盡量避免3個(gè)以上堿基重復(fù)，盡量減少發(fā)夾結(jié)構(gòu)形成的可能性。多數(shù)情況采用通用引物測序。2、經(jīng)典測序方法的反應(yīng)步驟模板變性退火標(biāo)記摻入標(biāo)記：[α-32P]dATP、[α-33P]dATP、[

5、α-35P]dATP末端標(biāo)記：[γ-32P]rATP延伸電泳分析和數(shù)據(jù)讀取三、序列分析的工作模式手動(dòng)測序缺點(diǎn)：工作強(qiáng)度大，操作人員要求技能嫻熟。測序長度有限。PCR測序全自動(dòng)測序用4種不同的羅丹明熒光染料分別標(biāo)記4種雙脫氧核苷酸。第三節(jié)DNA片段序列測定的策略一次測序反應(yīng)一般可讀出500-800bp，若待測序的DNA片段較大，則需從多處不同的位置引導(dǎo)測序反應(yīng)。通用引物指導(dǎo)未知序列的測定引物步移隨機(jī)克隆測序缺失克隆測序3.缺失克隆測序隨機(jī)克隆測序詳細(xì)過程：http://smcg.cifn.unam.mx/enp-unam/03-Estructur

6、aDelGenoma/animaciones/humanShot.swf