《蛋白互作研究方法》PPT課件

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1、蛋白質(zhì)相互作用研究方法王心宇CollegeofLifeSciences1研究蛋白質(zhì)相互作用的意義隨著生命現(xiàn)象的研究逐漸由獲取基因序列信息轉(zhuǎn)向研究基因功能,一門新的學科———蛋白質(zhì)組學proteomics應(yīng)運而生。蛋白質(zhì)組是一個在空間和時間上動態(tài)變化的整體,其功能往往是通過蛋白質(zhì)之間或與核酸之間相互作用而表現(xiàn)出來的,這種相互作用存在于機體每個細胞的生命活動過程中,相互交叉形成網(wǎng)絡(luò),構(gòu)成細胞中一系列重要生理活動的基礎(chǔ)。因此,對于蛋白質(zhì)相互作用interactome的研究就成為蛋白質(zhì)組學中最主要研究內(nèi)容之一。2蛋白質(zhì)相互作用常用研究方法1酵母雙雜交(Yeasttwo-hybrid,Y2

2、H)2pull-down3免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)4雙分子熒光互補技術(shù)(Biomolecularfluorescencecomplementation,BiFCorSplitYFP)5Far-westernanalysis3酵母雙雜交技術(shù)3.1原理DNA-bindingandactivatingfunctionsinatranscriptionfactormaycompriseindependentdomainsoftheprotein.Thetwohybridtechniqueteststheabilityoftwoproteins

3、tointeractbyincorporatingthemintohybridproteinswhereonehasaDNA-bindingdomainandtheotherhasatranscription-activatingdomain.3.2酵母雙雜交文庫構(gòu)建與篩選BDMatchmaker?LibraryConstruction&ScreeningKits誘餌蛋白載體構(gòu)建pGADT7-RecVectorInformation文庫構(gòu)建ConstructingADfusionlibrariesbyrecombination-mediatedcloninginyeast.cDN

4、AlibraryofoilseedrapelineRS-1constructedinyeastYeastcellsthataremating.Azygotetypicallyhasthree-lobedshape,thelobesrepresentingthetwohaploid(parental)cellsandthebuddingdiploidcells.LibraryscreeningbymatingPositiveclonesconfirmedonSD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-a-Gal檢測特定兩個蛋白是否互作pGADT7VectorInformati

5、on3.3膜蛋白互作研究方法－－－基于泛素的酵母雙雜交體系(mating-basedSplitubiquitinsystem"mbSUS“)1）GAL4體系的缺點2)MbSUS體系mbSUS原理InvivocloningintombSUSvectorsGATEWAYcloningmethod4pulldown1)原理2)試劑盒TheMagneGST.Pull-DownSystemFigure1.OverviewoftheMagneGST.Pull-DownSystemprotocol.P=PreyProtein,M=MagneGST.Particle.5免疫共沉淀Co-IP6Fa

6、r-westernanalysis雙分子熒光互補(bimolecularfluorescencecomplementation，BiFC)分析技術(shù)，利用綠色熒光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)及其突變體(YFP,CFP,BFP)的特性作為報告基因，將熒光蛋白分割成兩個不具有熒光活性的分子片段，再分別與目標蛋白連接.如果兩個目標蛋白因為有相互作用而靠近，就使得熒光蛋白的兩個分子片段在空間上相互靠近，重新形成活性的熒光基團而發(fā)出熒光.在熒光顯微鏡下，就能直接觀察到兩目標蛋白是否具有相互作用，并且在最接近活細胞生理狀態(tài)的條件下觀察到其相互作用發(fā)生的時間、位

7、置、強弱、所形成蛋白質(zhì)復(fù)合體的穩(wěn)定性，以及細胞信號分子對其相互作用的影響等，這些信息對研究蛋白質(zhì)相互作用有一定意義。7雙分子熒光互補技術(shù)BiFCPrincipleoftheBiFCassayGFP的特性綠色熒光蛋白(GFP)來源于水母(Aequoreavictoria)，分子質(zhì)量約為27kda，能在各種細胞中表達.受到激發(fā)時，不需要任何輔助因子，就能在活體中發(fā)出綠色熒光.1992年，Prasher等[2]克隆了GFP基因.隨后，GFP作為一種研究基因表達和蛋白質(zhì)定位的活體可遺傳標