《質(zhì)粒提取方法》PPT課件

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1、質(zhì)粒三種提取方法的比較基因工程原理與技術(shù)實驗部分：質(zhì)粒(Plasmid)是一種染色體外的穩(wěn)定遺傳因子,大小從1-200kb不等,為雙鏈、閉環(huán)的DNA分子,并以超螺旋狀態(tài)存在于宿主細(xì)胞中。質(zhì)粒主要發(fā)現(xiàn)于細(xì)菌、放線菌和真菌細(xì)胞中，它具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力,能在子代細(xì)胞中保持恒定的拷貝數(shù),并表達(dá)所攜帶的遺傳信息。在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi),共價閉環(huán)質(zhì)粒以超螺旋形式存在。在提取質(zhì)粒過程中，除了超螺旋DNA外，還會產(chǎn)生其它形式的質(zhì)粒DNA。如果質(zhì)粒DNA兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處斷裂,分子就能旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力,形成松馳型的環(huán)狀分子,稱開環(huán)DNA(OpencircularDNA,簡稱ocDN

2、A)；如果質(zhì)粒DNA的兩條鏈在同一處斷裂,則形成線狀DNA(LinearDNA)。當(dāng)提取的質(zhì)粒DNA電泳時,同一質(zhì)粒DNA其超螺旋形式的泳動速度要比開環(huán)和線狀分子的泳動速度快。實驗?zāi)康模?、學(xué)會小量制備質(zhì)粒DNA的堿裂解方法、煮沸法、小量一步提取法這三種質(zhì)粒DNA的提取方法。2、三種方法的比較，能夠根據(jù)不同的實驗?zāi)康倪x擇合適的方法。實驗原理：堿變性原理：根據(jù)共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA與線性DNA在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來分離。在pH12.0?12.5這個狹窄的范圍內(nèi)，線性DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而被變性。盡管在這項的條件下共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA也會變性，但兩條互補鏈彼此互相盤繞，仍會緊密

3、結(jié)合在一起。當(dāng)加入pH4.8的乙酸鉀高鹽緩沖液使pH恢復(fù)中性時，共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA復(fù)性快，而線性的染色體DNA復(fù)性緩慢，經(jīng)過離心與蛋白質(zhì)和大分子RNA一起沉淀下去。閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA，在變性后不會分離，復(fù)性快；DNA雙鏈變性DNA單鏈復(fù)性強堿中性染色體線性DNA和或有缺口的質(zhì)粒DNA變性后雙鏈分離，難以復(fù)性而形成纏繞的結(jié)構(gòu)，與蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物結(jié)合在一起，在離心的時候沉淀下去。變性煮沸法：將細(xì)菌懸浮于含TritonX-100和能消化細(xì)胞壁的溶菌酶緩沖液中，然后加熱到100℃使其裂解。加熱除了破壞細(xì)胞壁外，還有助于解開DNA鏈的堿基配對，并使蛋白質(zhì)和染色體DNA變性

4、。但是，閉環(huán)質(zhì)粒DNA彼此不會分離，這是因為他們的磷酸二酯骨架具有互相纏繞的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，當(dāng)溫度下降后，閉環(huán)DNA的堿基又各自就位，形成超螺旋分子，離心除去變性的染色體核蛋白質(zhì)，就可從上清中回收質(zhì)粒DNA由于細(xì)菌染色體DNA比質(zhì)粒大得多,受機械力后細(xì)菌染色體DNA會被震斷成不同大小的線性片段而纏繞附著在細(xì)胞碎片上，并發(fā)生變性。同樣受機械力質(zhì)粒DNA會變性，機械力后復(fù)性。但質(zhì)粒DNA的復(fù)性要快于細(xì)菌染色體DNA。小量一步提取法：從細(xì)菌中分離質(zhì)粒DNA的方法都包括3個基本步驟:1、培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴增2、收集和裂解細(xì)胞3、分離和純化質(zhì)粒DNA材料、設(shè)備及試劑一、材料含卡那酶素的E.

5、coliDH5α，1.5ml塑料離心管(又稱eppendorf管),離心管架。二、設(shè)備微量取液器(20μl,200μl,1000μl)，臺式高速離心機，恒溫振蕩搖床，高壓蒸汽消毒器(滅菌鍋)，渦旋振蕩器，電泳儀，瓊脂糖平板電泳裝置和恒溫水浴鍋等。三、試劑1、LB液體培養(yǎng)基(Luria-Bertani)：稱取蛋白胨(Tryptone)10g，酵母提取物(Yeastextract)5g，NaCl10g，溶于800ml去離子水中，用NaOH調(diào)pH至7.5,加去離子水至總體積1升,高壓下蒸氣滅菌20分鐘。2、LB固體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基中每升加12g瓊脂粉,高壓滅菌。3、氨芐青霉素

6、(Ampicillin,Amp)母液：配成50mg/ml水溶液,-20℃保存?zhèn)溆谩?、溶菌酶溶液：用10mmol/LTris·Cl(pH8.0)溶液配制成10mg/ml,并分裝成小份(如1.5ml)保存于-20℃,每一小份一經(jīng)使用后便予丟棄。5、3mol/lNaAc(pH5.2)：50ml水中溶解40.81gNaAc·3H2O,用冰醋酸調(diào)pH至5.2,加水定容至100ml,分裝后高壓滅菌,儲存于4℃冰箱。6、溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris.Cl(pH8.0)，10mmol/LEDTA(pH8.0)。溶液Ⅰ可成批配制,每瓶100ml,高壓滅菌15分

7、鐘,儲存于4℃冰箱。7、溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH(臨用前用5-10mol/LNaOH母液稀釋)，1％SDS。8、溶液Ⅲ：5mol/LKAc60ml，冰醋酸11.5ml，H2O28.5ml，定容至100ml,并高壓滅菌。溶液終濃度為:K+3mol/L,Acˉ5mol/L。9、RNA酶A母液：將RNA酶A溶于10mmol/LTris·Cl(pH7.5),15mmol/LNaCl中,配成10mg/ml的溶液,于100℃加熱15分鐘,使混有的DNA酶失活。冷卻后用1.5mleppendorf管分裝成小份保存于-20℃。10、飽