蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)

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1、實(shí)驗(yàn)二蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)一、免疫學(xué)研究抗原物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能；免疫應(yīng)答產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和功能；抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的規(guī)律。免疫學(xué)的研究范圍很廣，與很多相關(guān)學(xué)科交織在一起，并且發(fā)展成了很多學(xué)科，如免疫生物學(xué)、免疫遺傳學(xué)、血液免疫學(xué)、腫瘤免疫學(xué)等。隨著免疫生物學(xué)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)在高等動(dòng)物體內(nèi)存在著具有免疫功能的組織結(jié)構(gòu)（即免疫系統(tǒng)）。淋巴組織免疫活性細(xì)胞免疫活性介質(zhì)免疫系統(tǒng)功能的生理和病理表現(xiàn)功能名稱生理功能病理表現(xiàn)免疫防御清除病原微生物及其它抗原性異物超敏反應(yīng)（強(qiáng)）免疫缺陷?。ㄈ酰┟庖咦苑€(wěn)清除損傷或衰老細(xì)胞自身免疫性疾病免疫監(jiān)視清除突變或畸變細(xì)胞防止腫瘤發(fā)生腫瘤或病毒持續(xù)性殺傷病毒感染細(xì)胞感

2、染當(dāng)外源異體物質(zhì)，如細(xì)菌、病毒、蛋白質(zhì)、多糖等進(jìn)入動(dòng)物機(jī)體后，可以激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生對(duì)外源物質(zhì)的排除作用，從而保護(hù)機(jī)體免受外源物質(zhì)的侵害。機(jī)體的這一特異免疫應(yīng)答功能的細(xì)胞基礎(chǔ)是淋巴細(xì)胞。免疫應(yīng)答的類型（一）固有性免疫應(yīng)答（innateimmuneresponse)又稱先天性免疫應(yīng)答，非特異性免疫應(yīng)答：是機(jī)體在種系發(fā)育和進(jìn)化過程中形成的免疫防御功能。（二）適應(yīng)性免疫應(yīng)答（adaptiveimmuneresponse）又稱獲得性免疫應(yīng)答，特異性免疫應(yīng)答，是機(jī)體出生后通過與抗原物質(zhì)接觸后所產(chǎn)生的一系列防御功能。（具有特異性、多樣性、記憶性、耐受性、自限性）抗原和免疫原性抗原（antigen

3、s，Ag）是指能夠刺激機(jī)體免疫活性細(xì)胞產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細(xì)胞，并在體內(nèi)或體外發(fā)生特異性反應(yīng)的物質(zhì)。常見的抗原有蛋白質(zhì)、多糖、磷脂、脂多糖、結(jié)合蛋白質(zhì)、核酸、激素等有機(jī)物?？乖哂袃煞矫娴奶匦裕好庖咴裕╥mmunogenicity）和免疫反應(yīng)性（immunoreactivity）。免疫原性（immunogenicity）是指抗原刺激機(jī)體引起免疫應(yīng)答的能力。免疫反應(yīng)性（immunoreactivity）是指抗原與相應(yīng)免疫應(yīng)答產(chǎn)物(即抗體)在體內(nèi)或體外發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的能力。抗原的分類抗原可以分為完全抗原和半抗原。完全抗原：具有免疫原性和免疫反應(yīng)性的抗原稱為完全抗原（completeant

4、igen）半抗原：只具有免疫反應(yīng)性而無免疫原性的抗原稱為半抗原（hapten），也稱為不完全抗原(incompleteantigen)。與蛋白質(zhì)結(jié)合后成為完全抗原。半抗原能與相應(yīng)的抗體或致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)。絕大多數(shù)多糖和所有類脂都屬于半抗原?？贵w的種類抗體（antibodies，Ab)是專門對(duì)抗抗原特異結(jié)構(gòu)的球蛋白，故也稱為免疫球蛋白（immunoglobulins,Ig)。存在于血清、體液中，是構(gòu)成機(jī)體免疫作用的主要物質(zhì)。免疫球蛋白依據(jù)其理化性質(zhì)及生化性質(zhì)的不同，分為五種類型：IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。人體血清中IgG含量最多，IgA次之，IgM較少，IgD和

5、IgE微量?？乖贵w反應(yīng)（antigen-antibodyreaction）是指抗原與相應(yīng)抗體之間所發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)?？砂l(fā)生于體內(nèi)（invivo），也可發(fā)生于體外（invitro）。體內(nèi)反應(yīng)可介導(dǎo)吞噬、溶菌、殺菌、中和毒素等作用；體外反應(yīng)：可出現(xiàn)凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)、補(bǔ)體參與的反應(yīng)及中和反應(yīng)等各種不同的反應(yīng)類型。因抗體主要存在于血清中，在抗原或抗體的檢測(cè)中多采用血清作試驗(yàn)，所以體外抗原抗體反應(yīng)亦稱為血清學(xué)反應(yīng)（serologicreaction）。二、印跡法（blotting）印跡法是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的探測(cè)反應(yīng)來檢測(cè)樣品的一種方法。1975年，Southern建立

6、了將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA雜交檢測(cè)特定的DNA片段的方法，稱為Southern印跡法。人們用類似的方法，對(duì)RNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行印跡分析，對(duì)RNA的印跡分析稱為Northern印跡法，對(duì)單向電泳后的蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Western印跡法，對(duì)雙向電泳后蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Eastern印跡法三、蛋白免疫印跡的應(yīng)用免疫印跡法(immunoblottingtest,IBT)，亦稱酶聯(lián)免疫電轉(zhuǎn)移印斑法(enzymelinkedimmunoelectrotransferblot,EITB是一種將高分辨率凝膠電泳和免疫化學(xué)分析技術(shù)相結(jié)合的雜交技術(shù)。具有分析容

7、量大、敏感度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。是檢測(cè)蛋白質(zhì)特性、表達(dá)與分布的一種最常用的方法。蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)技術(shù)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?shí)驗(yàn)原理三、實(shí)驗(yàn)儀器四、操作步驟五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析六、思考題一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)掌握動(dòng)物抗血清的制備原理及技術(shù)通過實(shí)際操作學(xué)會(huì)動(dòng)物抗血清的制備掌握Western－blotting的基本原理熟悉Western－blotting的實(shí)驗(yàn)操作二、實(shí)驗(yàn)原理第一部分動(dòng)物的常規(guī)免疫及抗血清的制備第二部分Western－blotting