農(nóng)殘快速檢測(cè)法生化法

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1、湖南省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)檢中心李擁兵蔬菜上農(nóng)藥殘毒快速檢測(cè)技術(shù)（生化法檢測(cè)有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥）1速測(cè)法最低檢出濃度最高殘留限量引起中毒的殘留濃度低濃度高濃度儀器最低檢出濃度2試劑提取試劑磷酸緩沖液(磷酸氫二鈉+磷酸二氫鉀)PH-8膽堿酯酶底物碘化硫代乙酰膽堿(ATCI)碘化硫代丁酰膽堿(BTCI)顯色劑：二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)（乙酰膽堿酯酶或丁酰膽堿酯酶）3試劑的保存?酶：粉狀的酶應(yīng)保存在冷凍室內(nèi)（約-18度），用時(shí)用緩沖液（提取液）溶解，溶解后的酶液分成2-4小瓶，暫時(shí)不用的儲(chǔ)存在冷凍室內(nèi)，用時(shí)解凍，解凍后的酶液貯存在冷藏室內(nèi)（0-5度），酶液用后及時(shí)放回冰箱中冷藏，最好在一周內(nèi)用完，反

2、復(fù)解凍不能超過兩次，否則會(huì)影響酶的活性。?底物：固體及溶解后的底物均應(yīng)保存在冷藏室內(nèi)。?顯色劑：固體及溶解后的顯色劑均應(yīng)保存在冷藏室內(nèi)（0-5度）。?提取試劑：固體及溶解后的緩沖液只需在常溫下保存。?速測(cè)卡：未開封的速測(cè)卡可在常溫干燥下保存半年，10℃下保存一年。每小包速測(cè)卡開封后須在三天內(nèi)用完，應(yīng)密封保存。4檢測(cè)原理在對(duì)農(nóng)藥殘留的檢測(cè)中，如果蔬菜的提取液中不含有有機(jī)磷和氨基甲酸酯類的農(nóng)藥殘留或殘留量較低，酶的活性就不會(huì)被抑制，試驗(yàn)中加入的基質(zhì)就被酶水解或少部分水解，水解產(chǎn)物與加入的顯色劑反應(yīng)產(chǎn)生顏色。反之，如果蔬菜的提取液中含有一定量的有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥，酶的活性就被抑制，試驗(yàn)中加入的

3、基質(zhì)就不能被酶水解，從而不顯色或顏色變化很小，用分光光度計(jì)來測(cè)定反應(yīng)前后吸光值的變化，計(jì)算出抑制率，就可以判斷蔬菜中含有機(jī)磷或氨基甲酸酯農(nóng)藥的殘毒情況。5反應(yīng)方程式（以丁酰膽堿酯酶為例）1、（CH3）3NCH2CH2SCC3H9O（硫代丁酰膽堿）+H2OBchE37-380C（CH3）3NCH2CH2SH(硫代膽堿）+C3H9COOH(丁酸）2、（CH3）3NCH2CH2SH(硫代膽堿）+顯色劑黃色物質(zhì)底物酶6生化法檢測(cè)原理酶+有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥酶被抑制酶+樣本提取液酶活被抑制含有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥活性正常不含有機(jī)磷類或氨基甲酸酯類農(nóng)藥酶+擬除蟲菊酯類農(nóng)藥酶活不被抑制7分光光度法儀器

4、?分光光度計(jì)(RP-410或RP-420)?電子天平?微型混合器?培養(yǎng)箱?移液槍?取樣器?其他配件8檢測(cè)過程取2克樣本（非葉菜取4克），切碎加入20毫升提取試劑，震蕩1-2分鐘倒出上清液，靜置3-5分鐘試管或比色杯中加入50微升酶、3毫升樣本提取液、50微升顯色劑.在37-38?C下培養(yǎng)30分鐘.于待測(cè)的5只試管或比色杯內(nèi)加入50微升底物，于412納米波長(zhǎng)下比色。9452301前后樣品池5樣品池3樣品池1樣品池4樣品池20位池，調(diào)儀器狀態(tài)，要空置附1:RP-410型儀器樣品室平面圖：10吸光值A(chǔ)1A2CS1S2S3S4抑制率R1R2R3R43分鐘前吸光值空白吸光值樣本吸光值抑制率附2：打印結(jié)果

5、說明（1）、檢測(cè)1個(gè)空白、4個(gè)樣本打印結(jié)果如下3分鐘后吸光值11吸光值A(chǔ)1A2CS1S2S3S4S5抑制率R1R2R3R4R53分鐘前吸光值空白吸光值樣本吸光值抑制率3分鐘后吸光值（2）、檢測(cè)5個(gè)樣本打印結(jié)果如下12抑制率%=Inhibition%C-SC×100%抑制率%：酶被抑制的程度C:對(duì)照組3分鐘前后吸光度值之差S:樣本3分鐘前后吸光度值之差*對(duì)照組的比色杯中用3毫升提取試劑代替樣本提取液.結(jié)果計(jì)算13結(jié)果判定抑制率<70%（陰性）合格檢測(cè)結(jié)果以抑制率（%）表示抑制率?70%（陽性）根據(jù)市場(chǎng)管理規(guī)定處理用GC進(jìn)一步定性定量分析至少要2次以上重復(fù)檢測(cè)確認(rèn)14速測(cè)卡法儀器設(shè)備及試劑?PR-

6、3A農(nóng)殘速測(cè)儀?電子天平?速測(cè)卡?取樣器?其他配件15檢測(cè)過程取5克樣本，剪碎，放入燒杯中，加入10毫升純凈水，攪動(dòng)接通電源，打開PR-3A農(nóng)殘速測(cè)儀，預(yù)熱10分鐘，使之達(dá)到反應(yīng)設(shè)定的溫度（39℃）將速測(cè)卡沿中線對(duì)折，揭去速測(cè)卡保護(hù)膜，插入速測(cè)卡（紅色藥片向上，白色藥片置于加熱器上），然后在白色藥片上滴兩滴提取液。按“確認(rèn)”，不要合蓋，進(jìn)入第一次反應(yīng)倒計(jì)時(shí)。反應(yīng)倒計(jì)時(shí)進(jìn)入一半時(shí)，根據(jù)提示檢查是否需要加入提取液。.反應(yīng)完畢，合蓋進(jìn)入顯色反應(yīng)。顯色反應(yīng)完畢后，取出卡片，判讀結(jié)果16結(jié)果判定試紙顯示藍(lán)色合格以試紙顯示顏色為判斷標(biāo)準(zhǔn)白色為陽性根據(jù)市場(chǎng)管理規(guī)定處理用GC進(jìn)一步定性定量分析至少要2次以上重

7、復(fù)檢測(cè)確認(rèn)17速測(cè)卡片法中注意事項(xiàng)1、每批測(cè)定應(yīng)設(shè)一個(gè)洗脫液或純凈水的空白對(duì)照卡，樣品放置的時(shí)間應(yīng)與空白對(duì)照卡放置的時(shí)間一致才有可比性。2、空白對(duì)照卡不變色的原因：一是藥片表面緩沖液加得太少，預(yù)反應(yīng)后的藥片表面不夠濕潤(rùn)；二是反應(yīng)溫度太低。3、放置10分鐘進(jìn)行預(yù)反應(yīng)，預(yù)反應(yīng)后藥片表面必須保持濕潤(rùn)。白色藥片上水份不能蒸干，否則會(huì)出現(xiàn)假陽性。4、紅色藥片和白色藥片疊合反應(yīng)的時(shí)間為3分鐘。3分鐘后藍(lán)色會(huì)逐