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1、凝膠層析分離血紅蛋白與魚精蛋白一般性實驗-3背景層析法也稱色譜法，是1906年俄國植物學(xué)家MichaelTswett發(fā)現(xiàn)并命名的。他將植物葉子的色素通過裝填有吸附劑的柱子，各種色素以不同的速率流動后形成不同的色帶而被分開，由此得名為“色譜法”（Chromatography)。后來無色物質(zhì)也可利用吸附柱層析分離。英國生物學(xué)家Martin和Synge。他們首先提出了色譜塔板理論。1944年出現(xiàn)紙層析以后，層析法不斷發(fā)展，相繼出現(xiàn)薄層層析、親和層析、凝膠層析、氣相層析、高壓液相層析等。葉綠素通過碳酸鈣管柱所形成的色譜圖層析的兩種相固定相：固定相是層析的一
2、個基質(zhì)。它可以是固體物質(zhì)（如吸附劑，凝膠，離子交換劑等），也可以是液體物質(zhì)（如固定在硅膠或纖維素上的溶液），這些基質(zhì)能與待分離的化合物進行可逆的吸附，溶解，交換等作用。流動相：在層析過程中，推動固定相上待分離的物質(zhì)朝著一個方向移動的液體、氣體或超臨界體等，都稱為流動相。在柱層析中一般稱為洗脫劑，薄層層析時稱為展層劑。層析法是利用混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差異（如吸附力、分子形狀及大小、分子親和力、分配系數(shù)等），使各組分在兩相（一相為固定的，稱為固定相；另一相流過固定相，稱為流動相）中的分布程度不同，即各組分所受的固定相的阻力和流動相的推力影響不同
3、，從而使各組分以不同的速度移動而達到分離的目的。按層析過程的機理分類：分配層析:根據(jù)不同組分在不同溶劑中分配系數(shù)不同而使物質(zhì)分離的方法稱為分配層析。吸附層析:吸附是兩相成一界面，溶質(zhì)在表面密集的現(xiàn)象。以吸附劑為固定相，根據(jù)待分離物與吸附劑之間吸附力不同而達到分離目的的一種層析技術(shù)稱為吸附層析。常用吸附劑：活性碳、硅。離子交換層析:是以離子交換劑為固定相，根據(jù)物質(zhì)酸堿度、極性和分子大小差異而將物質(zhì)予以分離的一種方法。凝膠層析（分子篩）利用凝膠顆粒形成具有三維空間多孔性網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，不帶電荷，可起濾過或“篩”的作用。親和層析是利用生物分子間所具有的專
4、一性親和力的層析技術(shù)。層析法分類層析法分類按兩相所處的狀態(tài)分類：流動相有兩種狀態(tài)：液體作為流動相氣體作為流動相固定相也有兩種狀態(tài)：固體吸附劑作為固定相以吸附在固體上的液體作為固定相按兩相所處的狀態(tài)分為：液相層析和氣相層析流動相固定相液體（液相層析)氣體（固相層析）液體液-液層析氣-液層析固體液-固層析氣-固層析層析法分類名稱操作形式適用范圍柱層析將固定相裝于柱內(nèi)，使樣品沿一個方向移動而達到分離的目的。柱層析是常用的層析形式，適用于大量樣品分析、分離。生物化學(xué)中常用的凝膠層析、離子交換層析、親和層析、高效液相色譜等都通常采用柱層析形式。薄層層析將適當
5、粘度的固定相均勻涂鋪在薄板上，點樣后用流動相展開，使各組份分離。薄層層析主要適用于小分子物質(zhì)的快速檢測分析和少量分離制備，通常為一次性使用。按操作形式不同分類：吸附層析原理：任何兩個相都可以形成表面，其中一個相的物質(zhì)或溶解在其中的溶質(zhì)在此表面密集現(xiàn)象稱為吸附，利用吸附劑對不同物質(zhì)具有不同吸附力使混合物得到分的現(xiàn)象就叫吸附層析。凡能將其他物質(zhì)聚集到自己表面的物質(zhì)稱吸附劑，包括硅皮、氧化鋁、活性炭、淀粉、纖維素及陶土，而聚集于聚集于吸附劑表面的物質(zhì)稱被吸附劑。吸附劑與被吸附劑之間的作用除了物理作用外，還有化學(xué)作用，如DNS-氨基酸雙向聚酰胺薄膜層析時中
6、被分離的物質(zhì)之所以能吸附在聚酰胺薄膜上就是由于二者之間形成氫鍵。分配層析技術(shù)（液-液層析法）原理：利用混合物在兩種不相混溶的液相（固定相和流動相）之間的分配系數(shù)的不同而達到分離各組分的目的。紙層析是最廣泛的一種分配層析。特點：液-液層析法適合于分離同系物或同分異構(gòu)體分配層析技術(shù)分配系數(shù)小的溶質(zhì)在流動相中分配的數(shù)量多，移動快；分配系數(shù)大的溶質(zhì)在固定相中分配的數(shù)量多，移動慢。因此可彼此分開。分配系數(shù)主要與下列因素有關(guān)：①被分離物質(zhì)本身的性質(zhì)；②固定相和流動相的性質(zhì)；③層析柱的溫度。相關(guān)的概念（一）：分配系數(shù)：當一種溶質(zhì)分布在兩個互不相溶的溶劑中時，它在
7、固定相和流動相兩相內(nèi)的濃度之比是個常數(shù)，稱為分配系數(shù)(Kd)。分配系數(shù)是層析中分離純化物質(zhì)的主要依據(jù)Kd=Cs/Cm其中Cs:固定相中的濃度，Cm:流動相中的濃度分配層析技術(shù)相關(guān)的概念（二）：遷移率：在一定條件下，在相同的時間內(nèi)某一組分在固定相移動的距離與流動相本身移動的距離之比值。常用Rf來表示。物質(zhì)在一定溶劑中的分配系數(shù)是一定的，Rf值也是恒定的，因此可以根據(jù)Rf值來鑒定被分離的物質(zhì)。Rf=色斑中心至原點中心的距離溶劑前緣至原點中心的距離親和層析法親和層析（AffinityChromatography）是利用生物分子間專一性親和力而進行分離的一
8、種層析技術(shù)。如我們熟悉的：抗原和抗體；酶和底物或輔酶或抑制劑；激素和受體；RNA和其互補的DNA等。親和層析的分離原理簡單
