b_01 苯酚生物降解菌的篩選

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1、CentralLaboratoryofBiology苯酚生物降解菌的篩選目的要求1.掌握微生物分離純化的基本操作；2.掌握用選擇性培養(yǎng)基從土壤中分離苯酚生物降解菌的原理和方法?；驹肀椒邮且环N在自然條件下難降解的有機(jī)物，其長(zhǎng)期殘留于空氣、水體、土壤中，會(huì)造成嚴(yán)重的環(huán)境污染，對(duì)人體、動(dòng)物有較高毒性。因此采用一定的方式降解苯酚，對(duì)保護(hù)人類健康、消除環(huán)境污染意義重大。在提倡綠色環(huán)保的大前提下，采用生物降解的途徑勢(shì)在必行。微生物對(duì)污染物質(zhì)的代謝、轉(zhuǎn)化及降解作用，是當(dāng)今環(huán)境污染研究中最活躍的領(lǐng)域之一。自然界中

2、能降解烴類的微生物有幾百種，多為細(xì)菌、酵母菌和真菌，降解是由他們所產(chǎn)生的酶和酶系統(tǒng)完成的，一般直鏈化合物比支鏈化合物、飽和化合物比非飽和化合物、脂肪烴比芳香烴容易被較多種類的微生物降解和同化。直鏈烴的降解是末端甲基被氧化形成醇、醛后再生成脂肪酸，由脂肪酸形成醋酸，最后氧化成二氧化碳和水，微生物對(duì)單環(huán)芳烴及其衍生物的降解與直鏈烴類似，能降解苯和酚的微生物種類很多，細(xì)菌中的很多屬，放線菌等?；驹肀椒邮欠枷銦N化合物。苯酚是常用的表面消毒劑之一，它們是TCA（三羧酸）循環(huán)的抑制劑?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)某些假單胞菌、爭(zhēng)

3、論產(chǎn)堿菌、真養(yǎng)產(chǎn)堿菌含有芳香烴的降解質(zhì)粒，將其降解生成琥珀酸、草酰乙酸、乙酰CoA，進(jìn)入TCA循環(huán)。在苯酚濃度梯度培養(yǎng)基平板高含藥區(qū)上分離出的菌落，對(duì)苯酚具有較好的耐受性，可能具有分解酚菌的能力；然后將其在以苯酚為唯一碳源的培養(yǎng)基里進(jìn)行搖床培養(yǎng)，淘汰掉不能利用苯酚的菌株，可篩選到苯酚降解菌；再用不同濃度的苯酚藥物培養(yǎng)基分離，可篩選出耐受能力好，降解程度高的苯酚降解菌。實(shí)驗(yàn)用品1．材料：（樣品）　實(shí)驗(yàn)土樣采自校園肥沃土。2．器材和儀器：試管、250ml三角燒瓶、1mL吸管、吸耳球、無菌涂棒、量筒、天平、

4、滅菌鍋、培養(yǎng)箱、酒精燈、接種環(huán)、棉花、棉線、牛皮紙。3．試劑：牛肉膏蛋白胨苯酚K2HPO4KH2PO4MgSO4FeSO4瓊脂4.培養(yǎng)基2.以苯酚為單碳源的菌株的篩選1）單碳源培養(yǎng)基配制：按培養(yǎng)基D的配方，用250mL三角瓶，每瓶裝50mL，制成以苯酚為單碳源的液體搖瓶；2）苯酚的濃度設(shè)定：苯酚的濃度分別按0.2g/L，0.4g/L，0.6g/L，0.8g/L，1.0g/L，1.2g/L六個(gè)濃度梯度配制；3）平行樣：每菌株、每藥物濃度各配置平行樣兩瓶；4）滅菌：121℃，20min；5）接種：將初選的

5、苯酚耐受性菌株，分別用少許無菌水稀釋，接種于對(duì)應(yīng)搖瓶中；6）培養(yǎng)：八層紗布蓋口，回旋式搖床，30℃，100轉(zhuǎn)/min培養(yǎng)2天；7）檢測(cè)：用分光光度計(jì)測(cè)定OD值，以空白培養(yǎng)基作對(duì)照，檢測(cè)各搖瓶菌體濃度；8）篩選：淘汰掉不能利用苯酚為碳源的菌株。菌體濃度高的為生長(zhǎng)較好者，即能以苯酚為單碳源的菌株，可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。3.高耐受性苯酚降解菌的篩選1）藥物培養(yǎng)基平板的配制：按不同濃度（0.2g/L，0.4g/L，0.6g/L，0.8g/L，1.0g/L，1.2g/L）苯酚配置藥物培養(yǎng)基平板；2）滅菌、倒平板：1

6、21℃，滅菌20min，倒平板，各菌株、各濃度配置兩個(gè)；3）菌懸液制備：將初選的培養(yǎng)液作適度稀釋，或?qū)⒈２氐慕?jīng)單碳源實(shí)驗(yàn)的菌株用無菌水制成菌懸液；4）涂平板：用1mL移液管分別從各菌懸液試管中取菌懸液0.2mL涂布于藥物培養(yǎng)基平板上，每一試管菌懸液涂布一組不同濃度的苯酚藥物培養(yǎng)基平板，每一濃度設(shè)平板兩個(gè)，六組共計(jì)12個(gè)；5）培養(yǎng)：恒溫培養(yǎng)箱30℃培養(yǎng)1-2天；6）篩選：觀察、記錄并挑選高濃度藥物培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)旺盛的菌落，此即高耐受性苯酚降解菌，接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面；7）保藏：編號(hào)，4℃冰箱保

7、藏。實(shí)驗(yàn)結(jié)果平板編號(hào)12345678藥物濃度（g/L）0.10.10.10.10.10.10.10.1高藥區(qū)單菌落數(shù)1．苯酚耐受菌株的初選結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果藥物濃度（g/L）0.20.40.60.81.01.2菌種編號(hào)123452.以苯酚為單碳源的菌株的篩選結(jié)果（生長(zhǎng)情況OD值）藥品濃度（g/L）0.20.40.60.81.01.2菌株號(hào)123453.高耐受性苯酚降解菌的篩選結(jié)果（菌落數(shù)）實(shí)驗(yàn)結(jié)果注意事項(xiàng)1.各種培養(yǎng)基的配制應(yīng)嚴(yán)格按配方的要求完成，尤其是苯酚的稱量和pH；2.涂布梯度平板的菌懸液只作適度稀釋

8、，菌濃度不必過低；3.涂布平板的菌懸液不要過多或過少，0.2mL為宜；4.梯度平板上挑取菌落時(shí)，要挑取單菌落；5.單碳源實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件一定要嚴(yán)格把握。實(shí)驗(yàn)報(bào)告1.用三線表記錄實(shí)驗(yàn)步驟1-3所得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析。3.菌體、菌落形態(tài)的描述。生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心