蛋白質(zhì)的性質(zhì)及分離和純化

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1、第3章蛋白質(zhì)的通性、純化和表征蛋白質(zhì)的性質(zhì)蛋白質(zhì)的分離純化蛋白質(zhì)的性質(zhì)蛋白質(zhì)的兩性解離（酸堿性質(zhì)）蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)的變性和復(fù)性蛋白質(zhì)的紫外吸收蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)蛋白質(zhì)的沉淀蛋白質(zhì)分子除兩端的氨基和羧基可解離外，氨基酸殘基側(cè)鏈中某些基團(tuán)，如谷氨酸、天冬氨酸殘基中的?和?-羧基、賴氨酸殘基中的?-氨基、精氨酸殘基的胍基和組氨酸殘基的咪唑基，在一定的溶液pH條件下都可解離成帶負(fù)電荷或正電荷的基團(tuán)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一pH時(shí)，蛋白質(zhì)解離成正、負(fù)離子的趨勢(shì)相等，即成為兼性離子，凈電荷為0，此時(shí)溶液的pH稱為蛋白質(zhì)的等電

2、點(diǎn)。蛋白質(zhì)溶液的pH大于等電點(diǎn)時(shí)，該蛋白質(zhì)顆粒帶負(fù)電荷，反之則相反。蛋白質(zhì)的兩性解離體內(nèi)大多數(shù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)接近pH5.0，在體液pH7.4環(huán)境下可解離成陰離子。少數(shù)蛋白質(zhì)為堿性蛋白質(zhì)，如魚精蛋白、組蛋白等，也有少量蛋白質(zhì)為酸性蛋白質(zhì)，如胃蛋白和絲蛋白等。蛋白質(zhì)的電泳和離子交換層析技術(shù)就是依據(jù)蛋白質(zhì)的兩性解離性質(zhì)。蛋白質(zhì)在pH值低于或高于其pI時(shí)帶有電荷，在電場(chǎng)的作用下移動(dòng)，稱為電泳。由于各種分子所帶電荷的多少及分子量大小不同，因而它們?cè)陔妶?chǎng)中移動(dòng)速度也不同，可用于檢測(cè)、分離蛋白質(zhì)。根據(jù)支持物的不同，電泳可分為薄

3、膜電泳、凝膠電泳等，如凝膠電泳的支持物為瓊脂糖、淀粉或聚丙烯酰胺凝膠.酸性蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)為酸性，堿性蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)為堿性。等電點(diǎn)時(shí)蛋白質(zhì)的特性：溶解度最小，應(yīng)用于蛋白質(zhì)的分離、提純粘度最小滲透壓最小膨脹性最小導(dǎo)電性最小蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)是高分子化合物，分子直徑大小為1-100nm,屬于膠粒的范圍。維持蛋白質(zhì)膠體溶液穩(wěn)定的重要因素有兩個(gè)，一是蛋白質(zhì)膠體顆粒表面大多為親水基團(tuán)，可吸引水分子，形成顆粒表面水化膜；另一是蛋白質(zhì)膠粒表面帶有同種電荷。二者可起膠粒穩(wěn)定的作用，從而阻斷蛋白顆粒的相互聚集，防止溶液中蛋白質(zhì)的

4、沉淀析出。如除去蛋白膠粒上述兩個(gè)穩(wěn)定因素時(shí)，可使蛋白質(zhì)從溶液中析出。在蛋白質(zhì)分離中的鹽吸和丙酮沉淀就是依據(jù)這一原理。另外,蛋白是生物大分子，依據(jù)不同蛋白質(zhì)分子大小差異,在通過有分子篩作用的凝膠時(shí)受到排除力不同，可利用透析、凝膠過濾、分子篩層析、超離心等技術(shù)分離蛋白質(zhì)。由于蛋白質(zhì)的分子量很大，它在水中能夠形成膠體溶液。膠體溶液的性質(zhì)，如丁達(dá)爾現(xiàn)象、布郎運(yùn)動(dòng)、電泳現(xiàn)象、不能通過半透膜等。蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的因素：具有水化層，非等電點(diǎn)時(shí)帶電荷；應(yīng)用：利用透析法或超過濾法可純化蛋白質(zhì)：將非蛋白質(zhì)的小分子物質(zhì)除去，破壞蛋白質(zhì)膠

5、體的穩(wěn)定的因素，可以將蛋白質(zhì)分離蛋白質(zhì)的變性和復(fù)性蛋白質(zhì)在某些理化因素的作用下空間構(gòu)象受到破壞,從而改變其理化性質(zhì)，并失去其生物活性，稱為蛋白質(zhì)的變性(denaturation)。變性的實(shí)質(zhì)是蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象受到破壞,涉及二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu)的改變,二硫鍵及各種次級(jí)鍵破壞，但一級(jí)結(jié)構(gòu)不變，無(wú)肽鍵斷裂.變性后由于肽鍵松散，面向內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露于分子表面，蛋白質(zhì)分子溶解度降低并互相聚集而易于沉淀，其活性隨之喪失。另外表現(xiàn)為粘度增加,結(jié)晶能力消失，易被蛋白酶水解.造成蛋白質(zhì)變性的因素有多種，常見的有高溫、高壓、紫外線和乙

6、醇等有機(jī)溶劑、重金屬離子及生物堿等。在醫(yī)學(xué)上，上述變性因素可導(dǎo)致病源微生物蛋白的變性失活，常被用來消毒滅菌。相反，在蛋白質(zhì)分離純化過程中或有效保存蛋白質(zhì)時(shí)，應(yīng)防止蛋白質(zhì)變性。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)變性程度較輕，可在消除變性因素條件下使蛋白質(zhì)恢復(fù)或部分恢復(fù)其原有的構(gòu)象和功能,稱為復(fù)性(renaturation)。但許多蛋白質(zhì)或結(jié)構(gòu)復(fù)雜或變性后空間構(gòu)象嚴(yán)重破壞，不可能發(fā)生復(fù)性，稱為不可逆變性。蛋白質(zhì)的紫外吸收大部分蛋白質(zhì)均含有帶芳香環(huán)的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。這三種氨基酸在280nm附近有最大吸收。因此，大多數(shù)蛋白質(zhì)在280nm

7、附近顯示強(qiáng)的吸收。利用這個(gè)性質(zhì)，可以對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定性鑒定和定量測(cè)定。蛋白質(zhì)的呈色反應(yīng)蛋白質(zhì)分子中肽鍵可與某些試劑發(fā)生顯色反應(yīng)，且產(chǎn)生的有色物質(zhì)與蛋白質(zhì)濃度相關(guān)，氨基酸則不出現(xiàn)此反應(yīng)。此特性可用于蛋白質(zhì)定性、定量檢測(cè)，如雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)：雙縮脲反應(yīng)：雙縮脲在堿性溶液中與硫酸銅反應(yīng)產(chǎn)生紅紫色絡(luò)合物，此反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子大小與形狀蛋白質(zhì)分子的大?。?×104－1×106D蛋白質(zhì)分子的形狀：球形，纖維狀、橢圓形蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定①根據(jù)化學(xué)組成測(cè)分子量②凝膠過濾層析（分子篩層析）③SDS－PAGE法

8、④超離心法⑤滲透壓法①根據(jù)化學(xué)組成測(cè)分子量對(duì)含微量元素的蛋白質(zhì)，先測(cè)定微量元素的含量，然后確定最小分子量，如肌紅蛋白含鐵為0.335％，其最低相對(duì)分子量為;最低相對(duì)分子量=鐵的原子量×100/鐵的百分含量＝55.8×100/0.335=16700測(cè)定蛋白質(zhì)中氨基酸含量少的氨基酸②凝膠過濾（分子篩層析法）原理：蛋白質(zhì)分子通過層析柱的速度并不直接取決于分子質(zhì)量，而是它的斯托克