登革熱檢測(cè)方法

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1、附件1：免疫熒光法（IFA）檢測(cè)IgG抗體　　試驗(yàn)材料：　　（1）DV1～4型抗原片：DV標(biāo)準(zhǔn)毒株感染C6/36或BHK21細(xì)胞制備，低溫干燥保存；　　（2）對(duì)照：登革熱患者恢復(fù)期血清（陽(yáng)性對(duì)照），非登革熱患者血清陰性對(duì)照）；　?。?）羊抗人（或兔抗人）IgG熒光素標(biāo)記抗體；　?。?）常用稀釋液：pH7.2～7.4PBS、伊文思蘭等；　　（5）熒光顯微鏡?！　z測(cè)步驟：　?。?）用pH7.4，0.02mol/LPBS稀釋待檢血清，從1：20開(kāi)始做4倍連續(xù)稀釋至需要的稀釋度?！　。?）取出抗原片，

2、用蒸餾水漂洗后，冷風(fēng)吹干?！　。?）用加樣器依次從高稀釋度到低稀釋度逐個(gè)加入已稀釋的待檢血清，加入量以覆蓋細(xì)胞抗原面為準(zhǔn)（若為雙份血清，最好上排為急性期血清，下排為恢復(fù)期血清），在37℃水浴箱濕盒孵育30分鐘（每次試驗(yàn)設(shè)陽(yáng)、陰性對(duì)照）。　?。?）用PBS震蕩洗滌3次，每次5分鐘，再用蒸餾水洗滌1次脫鹽，冷風(fēng)吹干?！　。?）用含1：3萬(wàn)的伊文思蘭PBS按工作濃度稀釋熒光結(jié)合物，滴加各孔（以覆蓋細(xì)胞抗原面為準(zhǔn)），在37℃水浴箱濕盒孵育30分鐘，然后同（4）洗滌、漂洗、吹干?！　。?）熒光顯微鏡觀察結(jié)

3、果。　　結(jié)果判斷：　　細(xì)胞內(nèi)病毒特異性熒光為黃綠色顆粒，分布在感染細(xì)胞的胞漿內(nèi)。根據(jù)特異性熒光顆粒多少、熒光亮度、陽(yáng)性細(xì)胞在細(xì)胞總數(shù)中所占比例，可將免疫熒光反應(yīng)大致區(qū)分為1～4個(gè)“＋”?！　z測(cè)抗體滴度時(shí)，以能觀察到明顯特異性熒光反應(yīng)（＞“＋”）最高血清稀釋度的倒數(shù)表示?！　∫饬x：　　陽(yáng)性結(jié)果，表明曾受到DV感染，＞1：80有診斷參考意義；　　恢復(fù)期血清抗體滴度比急性期抗體滴度有4倍或4倍以上升高則可確診。　　附件2：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）　　檢測(cè)單份和/或雙份血清IgG抗體　　試驗(yàn)材料

4、：　　（1）抗原：　　陽(yáng)性抗原：采用C6/36細(xì)胞感染登革病毒培養(yǎng)物為陽(yáng)性抗原?！　￡幮钥乖何唇臃N病毒的正常C6/36細(xì)胞為陰性抗原對(duì)照?！　。?）辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG抗體；　?。?）緩沖液：　　包被液：pH9.6碳酸緩沖液；　　稀釋液：pH7.4PBS（含5%脫脂奶）　　洗滌液：pH7.4PBS－T（0.05％吐溫－20）；　　（4）顯色液：A/B液　?。?）終止液：4NH2SO4　　（6）酶標(biāo)板、酶標(biāo)儀?！　z測(cè)步驟：　　（1）用包被液按工作濃度稀釋抗原，100μl/孔，4℃過(guò)夜

5、；　　（2）棄去包被液，用PBS-T重復(fù)洗滌3～5次，甩干；　?。?）將待檢血清用稀釋液從1：100開(kāi)始作2或4倍連續(xù)稀釋，加入抗原孔，100μl/孔，同時(shí)設(shè)陰、陽(yáng)性對(duì)照，37℃水浴1小時(shí)；　?。?）棄去血清，用洗滌液洗滌5～6次；　?。?）加酶結(jié)合物，用稀釋液按工作濃度稀釋，100μl/孔，37℃水浴1小時(shí)；　?。?）棄去酶標(biāo)抗體，用洗滌液洗滌6次，甩干；　?。?）加顯色液：于各反應(yīng)孔內(nèi)加A/B液各一滴，37℃，避光3～5分鐘；　?。?）加終止液于每反應(yīng)孔，100μl/孔。　　結(jié)果判斷：　　于

6、450nm（TMB）陽(yáng)性對(duì)照孔OD值/陰性對(duì)照孔OD值，即P/N≥2.1，對(duì)照成立；若待檢血清孔OD值與陰性對(duì)照孔OD比值≥2.1，則標(biāo)本為登革熱IgG抗體陽(yáng)性，反之陰性。（陰性對(duì)照孔OD值小于0.05按0.05記，若大于0.05按實(shí)際數(shù)值計(jì)算）　　意義：　　陽(yáng)性結(jié)果，表明曾受到DV感染，＞1：100有診斷參考意義；　　恢復(fù)期血清抗體滴度比急性期抗體滴度有4倍或4倍以上升高則可確診?！　「郊?：IgM捕捉ELISA法（MacELISA）檢測(cè)登革熱IgM抗體　　試驗(yàn)材料：　?。?）抗原：　　陽(yáng)性抗

7、原：采用C6/36細(xì)胞感染登革病毒培養(yǎng)物為陽(yáng)性抗原?！　￡幮钥乖何唇臃N病毒的正常C6/36細(xì)胞為陰性抗原對(duì)照?！　。?）抗人IgM（μ鏈）單克隆抗體或多克隆抗體；　?。?）登革病毒IgM陽(yáng)性、陰性對(duì)照血清；　?。?）辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記登革病毒單克隆抗體；　?。?）緩沖液：　　洗滌液：pH7.4PBS－T（0.05％吐溫－20）；　　稀釋液：pH7.4PBS（5％牛血清）；　　封閉液：pH9.6碳酸緩沖液（1％牛血清白蛋白）；　　（6）顯色液：A/B液　?。?）終止液：4NH2SO4　　（8）酶

8、標(biāo)板、酶標(biāo)儀?！　z測(cè)步驟：　?。?）用稀釋液按效價(jià)稀釋抗人μ鏈單克隆抗體，100μl/孔，加蓋，4℃過(guò)夜；　?。?）棄去抗人μ鏈，用洗滌液重復(fù)洗3次，甩干，加封閉液，100μl/孔，置37℃水浴孵育2小時(shí)；　?。?）棄封閉液，用洗滌液重復(fù)洗3次，甩干。　?。?）將待檢血清用稀釋液從1：10開(kāi)始作2或4倍連續(xù)稀釋，加入酶標(biāo)板孔中，100μl/孔，同時(shí)加入已1：10稀釋的陽(yáng)性血清、陰性血清對(duì)照各4孔，100μl/孔，置37℃水浴孵育2小時(shí)；　?。?）棄去血清，用洗滌液重復(fù)洗3次，甩干，分別加4個(gè)型