液相色譜峰形問題 減少拖尾

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1、液相色譜峰形問題減少拖尾??2010-09-1706:46:08

2、??分類：?03液相色譜問答?

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5、2-26?-?百度快照三、峰形問題??峰形對稱性的優(yōu)劣對峰面積和分離度有很大的影響，從而影響分析結(jié)果的準確性。引起峰形異常的因素很多，柱外死體積引起峰形異常有個特點：對先出的峰影響大，對后出峰影響?。恢^塌陷、柱頭和篩板污染會引起所有的峰形都異常，而硅醇基次級保留只引起部分峰拖尾。相塌陷除了引起保留下降外，也會造成峰拖尾。色譜實踐中，大部分的峰形問題都不是色譜柱的問題，儀器參數(shù)設定、色譜條件和方法正確與否對峰形有很大影響。1.??峰后拖常見的3種拖尾情況：次級保留引起峰拖尾的機理解析：反相色譜中，通常非極性和弱極性的化合物能獲得良好的峰形，而帶有－

6、COOH、－NH2、－NHR、－NR2等極性基團的化合物則比較容易產(chǎn)生拖尾，原因是硅膠表面殘留硅羥基對極性和堿性樣品分子產(chǎn)生次級保留效應。??反相填料表面有殘余的硅羥基，具有一定的酸性，其pKa約為4.5～4.7。根據(jù)電離規(guī)律，流動相的pH－pKa>2即pH>6.7時，99％以上的硅羥基應該是呈離子狀態(tài)的，即Si－O－，而pKa－pH>2即pH<2.5時，酸性環(huán)境抑制了硅羥基的電離，99％以上的硅羥基應該是呈分子狀態(tài)的，即Si－OH，但其極性仍然存在，即Si－Oδ－Hδ＋。Si－Oδ－Hδ＋和－Si－O－對于極性化合物之間的作用力則是一種極性的靜電

7、作用力，這種作用力比范德華力要強得多。同時，因為硅膠表面鍵合了C18長鏈，由于空間位阻作用，樣品分子中能接觸到殘余硅羥基的機會不多，只有少部分的分子才能與殘余硅羥基產(chǎn)生強的靜電作用而被推遲洗脫出來，產(chǎn)生后拖。拖尾嚴重的程度與樣品分子極性大小和殘余硅羥基的多少有著直接的關(guān)系。??上圖是填料表面的示意圖，完全硅羥化的硅膠表面硅羥基濃度為8?mol/m2，由于空間位阻的作用，通常與C18硅烷基發(fā)生反應的僅達2～3.5?mol/m2，需要再用小分子的硅烷跟硅羥基反應，如圖中的三甲基氯硅烷，使硅羥基中的氫變成了三甲基硅烷的一個惰性基團。三甲基硅烷還是比氫原子

8、大得多，還是不能將所有的殘余硅羥基的活性封閉掉。??相同的樣品在不同品牌的柱子上產(chǎn)生拖尾的嚴重性不同，從填料合成的角度而言就是鍵合密度是否高、封尾是否徹底，高密鍵合和徹底的封尾能顯著減少這種機會，獲得良好的峰形。Welch公司Ulimate品牌的XB－C18、AQ－C18和XtimateC18采取的就是高密鍵合和徹底的雙峰尾工藝。解決方案：1）先檢查樣品是否過載，由于樣品過載引起的峰形后拖不能通過改變色譜條件消除。如果發(fā)現(xiàn)過載，需降低進樣量（包括進樣體積或濃度），進樣量越小，峰形越好，例子如頭孢尼西鈉的測定：2）調(diào)節(jié)流動相pH將流動相的pH調(diào)至比弱

9、酸pKa小2以上，比弱堿pKa大2以上，可有效抑制易離子化待測物的電離，從而取得良好峰形。例子如二甲基苯氧乙酸的測定：??堿性化合物中，甲胺的pKa為10.64，那么在pH<8.64的時候它是完全呈離子態(tài)的，那么pH在2.5~8.64時，特別是pH6.7～8.64時，此時甲胺和硅羥基均以離子狀態(tài)－NH3＋和Si－O－形式存在的，它們之間相互吸引的靜電作用導致后拖，這就是為什么很多堿性化合物在pH7.0的條件下容易產(chǎn)生拖尾的原因。而很多色譜柱生產(chǎn)商也因此以阿米替林（含－N(CH3)2，堿性比－NH2強）在pH7.0的條件下來評價和比較不同色譜柱之間的

10、優(yōu)劣，該條件下的阿米替林的峰形越好說明封尾越好。而在pH<2.5的條件下，也仍然后拖，是因為－NH3＋足夠強，即使硅羥基以分子狀態(tài)存在也仍能夠與Si－Oδ－Hδ＋中氧原子產(chǎn)生吸引作用，導致峰形拖尾。當pH>12.64，大于pKa2以上時，甲胺完全以分子狀態(tài)形式存在，不會引起拖尾。3）增加緩沖鹽或增大緩沖鹽的濃度：??流動相中加入緩沖鹽，增強了流動相的離子強度，在－NH3＋等極性基團和硅羥基Si－O－之間存在著許多離子的干擾，減少了樣品分子與硅羥基之間相互接觸的機會，有助于削弱極性基團與硅羥基之間的相互作用，改善峰形。這種適合于堿性較弱（如氨基的N原

11、子與強吸電子基相連），或堿性很強，但在剛性結(jié)構(gòu)中，比較難以接近被C18長鏈和封尾試劑覆蓋的硅羥基，例子如高烏甲素的測定：4