作業(yè)果膠酶的開(kāi)發(fā)

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1、高產(chǎn)果膠酶菌株的開(kāi)發(fā)一，酶的介紹果膠酶(Pectinase)是世界四人酶制劑之一，是分解果膠質(zhì)酶類的總稱，從廣義上來(lái)講，果膠陽(yáng)主要分為三類：(1)原果膠酶，可以把不溶于水的原果膠分解為可溶于水的高聚合體果膠。(2)果膠酯酶，脫去果膠中的甲氧基基團(tuán)，促使果膠的脫甲酯作用。(3)解聚酶，促使果膠屮的D-半乳糖醛酸的一1,4糖昔鍵的裂解。天然來(lái)源的果膠酶廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中，但動(dòng)、植物來(lái)源的果膠酶產(chǎn)量低難以人規(guī)模提取制備，微生物則是生產(chǎn)果膠酶的優(yōu)良生物資源，物屮，細(xì)菌、放線菌、酵母和霉菌都能代謝合成果

2、膠酶。我國(guó)學(xué)者對(duì)果膠酶菌種的選育始于上世紀(jì)80年代，研究領(lǐng)域主要集屮在曲霉菌屈。目前果膠酶廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)尤?其是果汁的捉取及葡萄酒的制作，果膠酶的生產(chǎn)采取的主要方法是黑曲霉的固體發(fā)酵與液體發(fā)酵，兩者在生產(chǎn)設(shè)備及節(jié)約成本方面仍冇待改進(jìn)。近年來(lái)隨著果汁與果酒行業(yè)的迅猛發(fā)展，對(duì)果膠IW的需求日益增大。篩選果膠酶高產(chǎn)菌株,優(yōu)化其發(fā)酵條件，是目前亟待研究的問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)旨在誘變篩選果膠酶的高產(chǎn)菌株采用深層液體發(fā)酵法優(yōu)化英發(fā)酵條件，為實(shí)現(xiàn)果膠酶的優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。二，研究?jī)?nèi)容菌株的篩選——菌株的鑒定——酶的

3、分離純化——酶學(xué)性質(zhì)研究——菌種的選育一酶的改性——酶反應(yīng)器的設(shè)計(jì)1,菌株的篩選(1)初篩(初復(fù)篩平板培養(yǎng)基：loomL查氏母液+0.5g果膠+2g瓊脂糖)A.從曲阜師范大學(xué)果樹(shù)下的泥土中取土樣稱取土樣1土樣2土樣3進(jìn)行三角瓶中滅菌，并在液體培養(yǎng)發(fā)酵基屮35°C下富集培養(yǎng)12小時(shí)B.稀釋涂布平板分別移取三個(gè)土樣的富集培養(yǎng)液0.ImL,加入裝有0.9mL無(wú)菌水的離心管中按101,102,1010105,106,進(jìn)行稀釋取稀釋102—106的菌懸液各0.2mL涂平板，每個(gè)梯度涂?jī)蓚€(gè)平皿,三個(gè)土樣共涂3

4、0個(gè)平皿35°C下恒溫培養(yǎng)3天（2）復(fù)篩A.平板復(fù)篩初篩平板張出后，用剛果紅染色法進(jìn)行平板染色后清洗觀察透明水解圈（透明圈法較為較為簡(jiǎn)單，有效，是口前最為常用的產(chǎn)果膠酶菌株的篩選分離方法）測(cè)量菌落直徑與透明圈直徑，用接種針挑取水解圈較大若干菌落進(jìn)行劃線分離純培養(yǎng)對(duì)劃線菌落進(jìn)行編號(hào)并記錄英初篩水解圈直徑及菌落直徑水解圈直徑劃線平板于35°C恒溫培養(yǎng)劃線平板長(zhǎng)出后，用接種針挑取單菌落點(diǎn)種與復(fù)篩平板上，在平板背面對(duì)點(diǎn)種菌落進(jìn)行標(biāo)記,35°C恒溫培養(yǎng)2天，用0.05%剛果紅溶液對(duì)復(fù)篩平染色，記錄相應(yīng)菌落的菌落

5、直徑與水解圈直徑，同吋接種到液體培養(yǎng)基屮培養(yǎng)48h,測(cè)定發(fā)酵液中的果膠酶酶活2.菌株的鑒定將篩選出的菌落直徑與水解圈較大的菌進(jìn)行純種鑒定A.觀察細(xì)胞的形態(tài)特征，觀察其運(yùn)動(dòng)性，營(yíng)養(yǎng)要求及生長(zhǎng)條件。B.通過(guò)紅外光譜，氣相色譜和質(zhì)譜等技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞組分。C.通過(guò)凝膠電泳的方法檢測(cè)其蛋口質(zhì)水平。D.通過(guò)16SRNA寡糖tt酸序列分析方法檢測(cè)其基因或DNA水平。3.酶的分離純化A?粗酶僅的制備由于產(chǎn)果膠酶菌是胞外酶產(chǎn)生菌，所以利用差速離心法去除培養(yǎng)液屮的菌體B.硫酸鍍鹽析將制的的粗酶夜通過(guò)硫酸鍍鹽析沉淀（Kiyo

6、shy等人采用85%飽和度的硫酸釵鹽析從白絹病菌中提取了聚半乳糖醛酸酶，其純化了8倍，酶收率為52%O酶收率相對(duì)較高，故采用此法）C.層析果膠酶通過(guò)硫酸錢鹽析之后，可以利用離子交換層析法對(duì)其進(jìn)行更深一步的提純。2.酶學(xué)性質(zhì)研究A.最適作用pH分別用不同pH值（2.0-8.0）的磷酸氫二鈉一檸檬酸緩沖液配制一定濃度的果膠溶液，按常規(guī)條件測(cè)定酶活。pll穩(wěn)定性測(cè)定；將上述不同pll的緩沖液分別在設(shè)定的不同溫度卜?處理2h后，再次測(cè)其酶活。B.最適作用溫度試管中加入0.5ml,pH值4.2的1%果膠，預(yù)熱5

7、min,加入經(jīng)適當(dāng)稀釋的酶液0.5ml,分別在35°C—65°C水浴條件下反應(yīng)30min,測(cè)其酶活。50ml燒杯中加入4.0ml,pH值4.0的1%果膠，預(yù)熱5niin,加入經(jīng)適當(dāng)稀釋的酶液1.Ornl,分別在35°C—65°C水浴條件下反應(yīng)60min,測(cè)定酶活。對(duì)熱穩(wěn)定性:粗酶液分別在30°C?6(TC之間水浴中保溫20min,立即冰浴，然后按常規(guī)條件測(cè)定三種果膠酶酶活。C.金屈離子對(duì)酶活的影響在酶液中加入金屬離了母液，使齊金屈離了的終濃度均為5mol/L,室溫下靜置30min,測(cè)定金屬離子存在下的

8、PG酶活力，以未加金屬離子實(shí)驗(yàn)組的酶活力為100%。5?菌種的選育結(jié)合山東省盛產(chǎn)梨的實(shí)際情況，將梨皮粉作為培養(yǎng)基的主要碳源進(jìn)行菌株的選育將蛋白月東，無(wú)機(jī)離子，水，梨皮粉配制成液體培養(yǎng)基，將之前獲得的透明圈直徑較大的混合菌進(jìn)行液體培養(yǎng)在三角瓶屮搖床培養(yǎng)2—3天取出菌液再放入梨皮粉含量高的液休培養(yǎng)基中，并在搖床中培養(yǎng)2-3天，取出菌液。利用稀釋涂布平板法將上述菌液接種到查式母液培養(yǎng)基上，使其在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使其長(zhǎng)出菌落。6.對(duì)酶的改性利用蛋白工程方法對(duì)酶進(jìn)行