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1、ICS?65.020.01B16?????DB37山東省地方標(biāo)準(zhǔn)DB37/T3630—2019?????小麥普通腥黑穗病菌分子檢測(cè)方法MoleculardetectionmethodsofTilletiafoetida&Tilletiacaries2019-07-23發(fā)布2019-08-23實(shí)施山東省市場(chǎng)監(jiān)督管理局???發(fā)布DB37/T3630—2019目??次前言II1范圍12術(shù)語(yǔ)和定義13儀器設(shè)備14主要試劑15分子檢測(cè)15.1小麥種子中小麥普通腥黑穗病菌冬孢子基因組DNA提取15.2菌癭中冬孢子基因組DNA提取25.3引物序列25.4PCR
2、擴(kuò)增25.5電泳檢測(cè)25.6檢測(cè)結(jié)果判斷36結(jié)果判定37樣品保存38檔案保存33DB37/T3630—2019前??言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并監(jiān)督實(shí)施。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：山東省植物保護(hù)總站、山東農(nóng)業(yè)大學(xué)。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：于金鳳、劉存輝、商明清、孫曉鳳、楊勤民、金揚(yáng)秀、李洪剛、張德滿、張莉、謝傳峰、徐魯、成文華。3DB37/T3630—2019小麥普通腥黑穗病菌分子檢測(cè)方法1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了小麥普通腥黑穗病菌的分子檢測(cè)方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于小麥普通腥黑穗病
3、菌的分子檢測(cè)。2 術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。2.1 小麥普通腥黑穗病菌 Tilletiafoetida&Tilletiacaries指引起小麥普通腥黑穗病的病原菌統(tǒng)稱，包括小麥光腥黑穗病菌（Tilletiafoetida）和小麥網(wǎng)腥黑穗病菌（Tilletiacaries）兩種。2.2 小麥普通腥黑穗病菌分子檢測(cè) MoleculardetectionofTilletiafoetida&Tilletiacaries指依據(jù)小麥光腥黑穗病菌（Tilletiafoetida）和網(wǎng)腥黑穗病菌（Tilletiacaries）的ITS序列，設(shè)計(jì)特異性
4、引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得特異性片段，依據(jù)特異性片段的有無進(jìn)行判斷檢測(cè)。3 儀器設(shè)備搖床、顯微鏡、普通離心機(jī)、電熱恒溫水浴鍋、移液器、超凈工作臺(tái)、PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、錐形瓶、離心管、蓋玻片、載玻片、電子天平等。4 主要試劑除特別說明外，本標(biāo)準(zhǔn)所用試劑均為分析純。CTAB緩沖液、Tris飽和酚、氯仿、異戊醇、異丙醇、乙醇、TE緩沖液、PCR緩沖液、dNTPs、TaqDNA聚合酶、DNAmarker、1×TAE緩沖液、瓊脂糖、DNALoading緩沖液、溴化乙錠、3mol/LNaOH溶液、1mol/LHCl溶液等。5 分子檢測(cè)5.1 小麥種子
5、中小麥普通腥黑穗病菌冬孢子基因組DNA提取5.1.1 稱取50g小麥種子放入250mL錐形瓶中，加入100mL無菌去離子水，試驗(yàn)重復(fù)3次。5.1.2 搖床200rpm振蕩5min后，靜置10min。收集洗滌懸浮液于100mL離心管，8000rpm離心10min，棄上清，留沉淀。3DB37/T3630—20191.1.1 加入1.5mL無菌水，充分混勻，轉(zhuǎn)至2mL離心管中，10000rpm離心5min，棄上清。1.1.2 用1mL無菌水沖洗100mL離心管2次，洗滌液一并轉(zhuǎn)移至2mL離心管，10000rpm離心2min，棄上清。1.1.3 加入1m
6、L濃度為3mol/L的NaOH溶液，65℃恒溫水浴30min。取出離心管，用1mol/LHCl溶液中和，10000rpm離心2min，吸出上清液，加無菌水沖洗沉淀4次，離心，吸出上清液。1.1.4 向離心管內(nèi)加入700μL預(yù)熱至65℃的CTAB緩沖液，65℃水浴1h，每隔15min顛倒混勻1次。1.1.5 待冷卻至室溫，加入等體積的Tris飽和酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1），充分混勻，抽提2次～3次。1.1.6 10000rpm離心10min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的2ml離心管中，加入等體積的氯仿∶異戊醇（24∶1），充分混勻，抽提2次～3次。1
7、.1.7 10000rpm離心10min，吸取上清液至1.5mL離心管中，加入等體積預(yù)冷至-20℃的異丙醇，輕輕顛倒混勻，室溫放置30min。1.1.8 12000rpm離心15min，棄上清液，留沉淀。1.1.9 加入1mL70%乙醇沖洗管底的沉淀，12000rpm離心5min，棄上清液，重復(fù)2次。1.1.10 12000rpm離心30s，去除殘余的乙醇。1.1.11 置于超凈操作臺(tái)內(nèi)干燥約15min。1.1.12 加入30～50μLTE緩沖液溶解DNA。注：也可采用經(jīng)驗(yàn)證等效的該DNA提取試劑盒，按照試劑盒使用說明書提取。1.2 菌癭中冬孢子
8、基因組DNA提取取小麥病穗中的菌癭，用鑷子壓破，釋放并收集里面的冬孢子，轉(zhuǎn)至2mL離心管，采用CTAB法（詳見5.1.5～5.1.14）
